D-氨基酸抑制变链菌SpaP蛋白参与生物膜分散作用的机制研究

Streptococcus mutans adhesion to the surface of teeth by biofilm mode is the one of its cariogenicity. S. mutans cell surface-localized adhesin called SpaP which is an amyloid forming protein plays an important role in the formation of biofilm. A few bacteria in biofilms age can generate D-amino acid which inactivates the surface amyloid fiber and disperse bacteria in biofilm in order to avoid the disadvantage environment such as metabolites aggregation and nutrition deficiency. In this study, a prokaryotic expression is performed for the C-terminal domain of SpaP and then the monoclonal antibody was made. SpaP protein as well as its corresponding genes is evaluated in the biofilm age using immunocytochemistry, immunogold electron microscopy, fluorescence in situ hybridization, etc.. A high performance liquid chromatography is employed to evaluate the components of D-amino acid in S. mutans biofilm age and disperse roles of exogenous D-amino acid. Furthermore, disperse mechanism of S. mutans in biofilm age was explored by the construction of S. mutans △murI and △alr. We wish the studies ultimately provide a new method for the inhibition of S. mutans biofilm and reduction of cariogenicity.

变链菌通过生物膜方式粘附在牙齿表面是其致龋力的主要原因之一，变链菌SpaP表面蛋白具有淀粉样纤维的粘附特性，对于变链菌生物膜形成起着重要作用。许多细菌在生物膜老化期能产生D-氨基酸阻碍细菌表面淀粉样纤维功能，发挥分散生物膜内细菌的作用，克服生物膜老化期细菌代谢产物聚集和营养溃乏的不利环境。本研究对变链菌SpaP蛋白C端多肽进行原核表达，制备单抗，通过免疫细胞化学、胶体金免疫透射电镜、荧光原位杂交等技术检测SpaP蛋白和相关基因在变链菌生物膜老化期表达；通过高性能液体色谱鉴定变链菌生物膜老化期产物中D-氨基酸的成份，检测外源性D-氨基酸对变链菌生物膜分散能力；并通过构建变链菌谷氨酸和丙氨酸消旋酶基因突变株△murI 和△alr，分析变链菌在生物膜老化期细菌分散机制，从而为抑制变链菌生物膜和降低致龋率提供新的研究思路。

D-氨基酸是细菌胞壁中的重要成份之一，在维持细菌菌体固有形态，保护细菌抵抗低渗环境中发挥着重要的作用。许多细菌在生物膜老化期能产生D-氨基酸，阻碍细菌表面的淀粉样纤维功能，发挥分散生物膜细菌的作用。变异链球菌SpaP表面蛋白具有淀粉样纤维的粘附特性，对于变链菌生物膜形成起着重要作用。本研究首先通过SpaP蛋白C端多肽的进行原核表达，合成单抗，但在变链菌生物膜SpaP蛋白的检测中，敏感性不高，可能是因为SpaP蛋白具有较复杂的二和三级结构，原核表达产物不能完全代表SpaP蛋白的正常特性。我们调整实验方案，选择18种D-氨基酸联合乳酸链球菌肽进行变链菌的抗菌实验、生物膜结晶紫实验、扫描电镜和激光共聚焦实验，得出D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸能阻碍变链菌生物膜生成，特别三种D-AA联合时具有显著的协同效应。..变链菌中具有2种氨基酸消旋酶，谷氨酸消旋酶MurI和丙氨酸消旋酶Alr，我们构建变链菌△murI 和△alr突变株。D-谷氨酸在变链菌中是由L-谷氨酸通过谷氨酸消旋酶转变生成的，是变链菌细胞壁的重要组成部分，同时可以抑制变链菌生物膜生成。我们采用聚合酶链反应和基因重组技术，克隆出变链菌UA159谷氨酸消旋酶基因并进行原核表达，通过MurI抑制剂D-谷氨酰胺，发现在亚最小抑菌浓度时能有效抑制变链菌耐酸和生物膜形成能力，降低gtfB、gtfC、atpD、ldh和comD表达；通过构建murI同源重组质粒，转化入变链菌，利用同源重组原理构建murI基因突变株，并通过Southern bolt，PCR和测序验证，命名为S. mutans FW1718。S. mutans FW1718的产酸、耐酸、合成胞外基质及形成生物膜的能力均显著降低。实时荧光定量PCR 实验结果显示生物膜形成相关基因comE, comD, gtfB,gtfC，ldh，aptD和spaP在S. mutans FW1718的转录水平均显著低于野生株。实验进展期间，因为已有新文献表明△alr突变株细菌生物膜形成未减弱，未再重复实验。本课题实验显示D-氨基酸对变链菌生物学性能具有重要影响，D-谷氨酸不仅是细菌胞壁重要组织部分，也可抑制生物膜形成，因此谷氨酸消旋酶有望成为预防龋病的作用新靶点。