亚抑菌浓度头孢他啶抑制大肠埃希菌生物膜的作用及机制研究

Therapy of bacterial biofilm(BF)-associated infections is still a great challenge in clinical. Inhibition of quorum sensing (QS) pathways is thought to be a potential effective means for treating the bacterial BF-associated infections. Our preliminary research results promote us to hypothesize that the subinhibitory concentrations of ceftazidime do not affect the bacterial growth, but are able to inhibit the BF formation in Escherichia coli.which primarily through inhibiting the effect of luxS/AI-2 QS system. In present study,we using the BF formation-positive E. coli strains MG1655 (an non-pathogenic laboratory strain) and O157:H7 (an enterohemorrhagic strain) as the model organisms, the luxS null mutants and their corresponding complemented mutants, as well as all these wild-type and mutant strains expressing the fused LuxS-green fluorescent protein will be constructed. Base on the relative levels of BF formation and fluorescence expression in the above strains, at the optimized inhibitory concentrations thedesigned time points,action of ceftazidime against BF formation will be determined, and then the changes in bacterial morphology,BF formation, synthesis, transport and phosphorylation of AI-2 signal molecule, and transcriptional level of luxS operons will be characterized upon the ceftazidime treatment at the optimized conditions. The key mechanism of sub-MIC ceftazidime which inhibiting the biofilm formation of E coli QS in this study will provide the theoretical basis for the prevention and treatment of bacterial biofilm-associated infections.

细菌生物膜感染是临床亟待解决的难题，抑制群体感应系统（Quorum sensing,QS）被认为是解决该问题的关键途径。我们前期研究显示亚抑菌浓度头孢他啶在不影响大肠埃希菌生长时,能抑制并部分逆转其生物膜形成，同时发现作用过程中luxS/AI-2群体感应系统luxS表达降低。推测其抑制大肠埃希菌QS系统可能是抑制生物膜形成的关键机制。本项目拟以大肠埃希菌为研究对象，构建luxS基因缺失和luxS-绿色荧光蛋白融合表达株，根据荧光表达和生物膜形成变化等确定头孢他啶对QS的最佳抑制浓度和时间，以luxS回补株和动物实验验证其作用后，分析AI-2信号的合成、转运和磷酸化，并通过同源重组改变其与抗菌作用靶点青霉素结合蛋白的结合能力，检测大肠埃希菌形态、生物膜形成和luxS表达变化，明确其抑制生物膜形成的机制。本项目的完成为抑制生物膜的形成研究提供实验证据、对丰富抗感染理论具有重要意义。

大肠埃希菌形成生物膜是其耐药的主要原因。在临床抗感染治疗中，亚抑菌浓度（亚-MIC）抗菌药物的存在是不可避免的。然而，亚-MIC抗菌药物对细菌生物膜形成的影响机制尚不明确，群体感应系统对抗菌药物的响应可能是主要机制之一。因此本项目构建大肠埃希菌MG1655 luxS基因缺失和luxS-EGFP蛋白融合表达株，检测亚-MIC头孢他啶对细菌生物膜形成能力、群体感应系统及AI-2信号分子相关基因表达的影响。结果显示，1/4MIC头孢他啶对MG1655生物膜形成、构成AI-2转运泵和磷酸化基因的表达具有抑制作用，但luxS基因敲除后对这些指标则没有影响。亚-MIC头孢他啶对luxS基因及AI-2合成具有抑制作用。小鼠动物模型试验结果显示亚-MIC头孢他啶处理过的大肠埃希菌对小鼠膀胱组织感染能力降低。上述结果提示亚-MIC头孢他啶可能通过luxS/AI-2抑制大肠埃希菌生物膜的形成。然后，利用同源重组构建了青霉素结合蛋白mrcA、mrcB、ftsI基因敲除菌株，观察细菌生长、生物膜、粘附、运动性、鞭毛及鞭毛生成相关基因的变化，探索亚-MIC头孢他啶影响生物膜的可能靶点。结果显示，mrcA、mrcB、ftsI基因敲除对细菌生长没有影响，mrcB基因敲除株生物膜形成能力、粘附性、运动性、鞭毛数量及鞭毛生成相关基因较野生株具有显著性降低，而mrcA及ftsI基因敲除株与野生株没有显著性差异。亚-MIC头孢他啶作用后，药物对mrcB基因敲除株的生物膜形成、粘附、运动性及鞭毛生成相关基因的抑制作用减弱或没有差异。提示PBP1b缺失的大肠埃希菌鞭毛生成相关基因表达降低导致鞭毛数量减少，运动能力降低，从而细菌的粘附能力及生物膜形成能力降低，PBP1b是亚-MIC头孢他啶抑制E. coli生物膜形成的主要靶点。总之，本研究表明亚-MIC头孢他啶与PBP1b结合通过luxS/AI-2抑制大肠埃希菌生物膜的形成。本项目的完成为细菌生物膜感染的控制提供实验证据，丰富了抗感染理论。