TLR4介导的Kupffer细胞活化在高脂、高果糖饮食诱导NAFLD小鼠炎症启动中的作用

目前单纯脂肪肝患者炎症如何启动进展为非酒精性脂肪性肝炎机制尚不清楚。本研究拟采用高脂、高果糖饮食诱导C3H/HeN（TLR4+/+）小鼠建立一种新的NAFLD小鼠模型，和TLR4 mut/mut小鼠比较，并以鱼油（含不饱和脂肪酸）混合饮食进行干预，研究TLR4介导的Kupffer细胞活化在NAFLD早期炎症启动中的作用以及不同脂肪酸对其影响。比较4、8和16周各组小鼠肝组织病理学评估肝脂肪变和炎症等变化；分离、纯化、培养Kupffer细胞后测定其活化数量和功能；以肝组织和kupffer细胞TLR4、MyD88、IRF3和7、TNFa蛋白和/或mRNA表达为主要指标，观察NAFLD小鼠炎症发生过程中TLR4信号通路的变化以及和KC活化的关系；并测定门静脉FA和内毒素水平，观察不同FA和LPS对Kupffer细胞TLR4信号通路的影响，以阐明NAFLD早期炎症启动的分子学机制。

目前单纯性脂肪肝患者炎症如何启动进展为非酒精性脂肪性肝炎机制尚不清楚，本研究模拟人类饮食习惯采用高脂高果糖饮食诱导C3H/HeN(TLR4+ /+)建立一种新的NAFLD小鼠模型，和TLR4mut/mut小鼠比较，并以鱼油（含不饱和脂肪酸）混合饮食进行干预，研究TLR4介导的Kupffer细胞活化在NAFLD早期炎症，启动中的作用以及不同脂肪酸对其影响，采用HE、油红O、Masson染色检测检测4、8、16周各组小鼠肝组织病理学评估肝脂肪变和炎症等变化；采用免疫组化、RT PCR及Western blot检测TLR4信号通路中信号分子的表达，免疫荧光双标记检测Kupffer细胞的数量及活化率。采用巨噬细胞吞噬实验检测干扰TLR4对巨噬细胞吞噬功能的影响。发现（1）高脂高果糖饮食喂饲16周可诱导小鼠出现典型的NASH肝脏组织学改变和肥胖等代谢表型。（2）NAFLD形成涉及肝组织中KCs活化及其相关信号通路的激活。（3）TLR4信号通路在介导高脂高果糖诱导的NAFLD小鼠Kupffer细胞活化中起着关键重要作用，TLR4突变抑制Kupffer细胞活化。（4）TLR4信号通路在NAFLD病程进展中参与脂质沉积、脂肪变、炎症和肝纤维化。（5）RNA干扰TLR4信号通路能降低Kupffer细胞的吞噬功能。（6）鱼油干预可减轻NAFLD病程中的炎症和纤维化，但对减轻脂质沉积、脂肪变作用不明显。上述结果证实了原提出的“饱和脂肪酸作为TLR4配体，协同LPS通过激活MyD88依赖的信号转到途径，活化KC从而启动NAFL炎症反应；而不饱和脂肪酸通过抑制TLR4信号通路而发挥防治作用。”的假说。阐明了TLR4介导的KC活化在NAFL炎症启动中的作用及分子机制，为临床早期干预提供了靶点及策略。