绒毛蛋白对棉花纤维细胞骨架和纤维伸长发育的调控作用

Villin is an actin binding protein, playing important roles in plant cell polar growth by regulating organization and dynamics of actin filaments. However, the functions of this type of genes are unknown in cotton. A villin protein was identified to be down-regulated in the fibers of the Ligon lintless-1 mutant in our proteomics study. The gene encoding this protein was cloned and designated as GhVLN, and this gene showed to be predominantly expressed in normal fibers, and significantly enhance longitudinal elongation of Schizosaccharomyces pombe. In the present project, the recombinant GhVLN protein will be expressed in Escherichia coli and purified for determination of the ability of this protein to bind actin filaments, and the activities of this protein in actin polymerization, depolymerization, capping and bundling, along with the effects of calcium and calmodulin on those activities. The function of GhVLN will be verified by over expression transgenic cotton lines and RNAi-mediated gene silencing. The distribution, organization, dynamics of cytoskeletons, distribution of Calcium, and microfibril deposition pattern in cotton fibers will be investigated in vivo at various development stages and in vitro culture at intervals. Furthermore, the effects of F-actin polymerization inhibitor, Calcium availability and caffeine on actin cytoskeleton of the cultured cotton in vitro will also be analyzed. The roles of GhVLN in regulation of cytoskeletons in cotton fiber cells and therein cotton fiber development will be illuminated integrally.

绒毛蛋白是一种肌动蛋白结合蛋白，调控肌动蛋白纤丝组织和动态变化，对植物细胞极性生长起重要作用。但棉花这类基因的功能未知。蛋白质组学研究鉴定到一个绒毛蛋白在李氏无长绒纤维突变体（Li1）纤维中下调表达。克隆该基因，定名为GhVLN，GhVLN在正常纤维中优势表达，还能促进酵母的纵向伸长。本项目通过原核表达分离纯化该蛋白质，分析它在体外与F-actin结合及其对微丝聚合、解聚、加帽、成束化活力，以及Ca2+、钙调素等对这些活力的影响；通过GhVLN过表达和RNAi介导的基因沉默验证该基因的功能；分析野生型、Li1、过表达和RNAi转基因棉花体内发育不同阶段和离体培养不同时期纤维细胞骨架的分布、组织及其动态变化，Ca2+分布，纤维素微纤丝沉积特征；分析F-actin多聚化抑制剂、Ca2+、咖啡因等对离体培养纤维肌动蛋白骨架的效应。全面阐述GhVLN对棉花纤维细胞骨架、纤维发育的调控作用。

绒毛蛋白是一种肌动蛋白结合蛋白（ABP），调控肌动蛋白纤丝组织和动态变化，对植物生长发育起重要作用。但棉花这类基因的功能未知。蛋白质组学研究鉴定到一个绒毛蛋白在李氏无长绒纤维突变体（Li-1）纤维中下调表达。克隆该基因，定名为GhVLN4。原核表达、分离、纯化该蛋白质，高速共沉淀和低速共沉淀分析结果表明GhVLN4在体外能与F-actin结合并使之捆绑成束，荧光共定位分析结果证实在烟草细胞中，该蛋白质与F-actin定位重合，表明在活体细胞中GhVLN4与微丝骨架结合。GhVLN4基因在棉花根、茎和快速伸长的纤维中优势表达，受GA3处理诱导上调表达，且在正常纤维中表达水平远高于纤维不能正常伸长的突变体纤维；异源过表达GhVLN4促进裂殖酵母细胞极性伸长，并将细胞中片状微丝转变为轴向排列的束状微丝；过表达GhVLN4显著促进拟南芥根、茎、花粉管伸长，并使根毛细胞中微丝捆绑成束。因此GhVLN4通过重塑微丝骨架为高级结构促进细胞伸长。. 克隆并分析GhVLN4基因的启动子区发现其具有水杨酸（SA）、真菌、逆境胁迫应答顺式作用元件；SA、茉莉酸、乙烯、ABA、NaCl、大丽轮枝菌Vd991等均可不同程度诱导棉花GhVLN4上调表达。过表达GhVLN4可以显著提高拟南芥种子萌发期、幼苗期、营养生长后期的耐盐性和耐旱性。盐和干旱胁迫下气孔开度减小，Fv/Fm值维持较高水平。过表达GhVLN4拟南芥中依赖于ABA的细胞早期脱水反应基因和延迟逆境反应基因、脯氨酸和活性氧清除剂合成基因上调表达。VIGS沉默GhVLN4棉花对大丽轮枝菌Vd991更为敏感，过表达GhVLN4显著提高拟南芥对大丽轮枝菌Vd991的抗性，水杨酸、乙烯和茉莉酸抗病信号通路中的关键基因表达发生显著改变。其中，对水杨酸信号通路、短肽激素的诱导，以及对乙烯逆境应答基因的影响可能起关键作用。本研究结果首次指出GhVLN4可以从转录水平上调控棉花纤维发育以及植物抗逆作用基因的表达，一些ABP可能不仅仅局限于通过重塑微丝骨架结构对植物的生命活动其调控作用，为进一步解释肌动蛋白结合蛋白和微丝骨架的功能提供了新的线索。