高盐极端环境微生物Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆与功能研究

Na+/H+逆向转运蛋白对高盐极端环境微生物的环境适应起着十分重要的作用。本项目提取和纯化盐湖沉积土样的微生物宏基因组DNA，通过功能驱动筛选策略和序列分析，获得若干Na+/H+逆向转运蛋白基因。选择其中1个基因，通过亚克隆构建仅携带单一目的基因的重组子；测定重组子在不同NaCl、LiCl浓度和不同pH条件下的生长能力差异；利用荧光分光光度计测定由重组子制备的翻转膜中Na+(Li+、K+)/H+逆向转运蛋白的活性、翻转膜在不同pH下转运Na+、Li+、K+等单价阳离子的活性变化趋势，以及对单价阳离子的表观Km和Vmax；对目的基因中若干编码跨膜区保守氨基酸残基的核苷酸进行定点突变，并对突变体进行功能特性研究。本项目对挖掘新的微生物Na+/H+逆向转运蛋白基因资源以及深入揭示高盐极端微生物的环境适应机制等具有重要意义。

Na+/H+逆向转运蛋白对高盐极端环境微生物的环境适应起着十分重要的作用。本项目对新疆达坂盐湖沉积土样进行微生物群落结构多样性研究，结果表明，新疆达坂盐湖沉积土壤的富集培养物中存在种类较丰富的嗜盐细菌，随机挑选的100个克隆分属细菌域的9属27种，芽孢杆菌属为优势菌群(48%), 喜盐芽孢杆菌属(14%)、盐单胞菌属(13%)为次优势菌群，其中10个克隆子与GenBank中已报道16S rRNA基因序列的相似性在88.80%-96.90%之间, 可能代表新属或新种。.通过功能驱动筛选和亚克隆，共获得4个新的Na+/H+逆向转运蛋白基因，分别命名为nhad1，nhar，psmrA和psmrB。nhad1预测编码含426个氨基酸、具有11个推测跨膜区的蛋白，与C. sticklandii DSM 519的砷泵蛋白家族的同源性最高（63%）；nhar预测编码含392个氨基酸、具有10个推测跨膜区的蛋白，与A. metalliredigens QYMF和A. arabaticum DSM 5501的Na+/H+逆向转运蛋白的同源性最高（65%）。携带nhad1的大肠杆菌KNabc能耐受0.5mol/L的NaCl。Nhad1具有高的Na+/H+和Li+/H+逆向转运蛋白活性，最适活性pH为7.0，无K+/H+逆向转运蛋白活性，对Na+和Li+的Km值分别为1.45和2.94。.psmrA和psmrB分别编码含114个和104个氨基酸残基的跨膜蛋白，与目前已知的所有单亚基和多亚基Na+/H+逆向转运蛋白之间均不存在同源性，与具有Na+/H+逆向转运蛋白活性的TetA(L)和MdfA蛋白之间亦不存在同源性，因此， PsmrAB可能为一个新的双组分Na+/H+逆向转运蛋白，这是有关PSMR家族成员具有Na+/H+逆向转运蛋白活性的首例报道。对psmrB编码蛋白的3个跨膜区可能与离子转运和pH 调控相关的5 个保守的氨基酸残基（L6，E13，K21，Y59，T63）进行定点突变。突变体L6A、E13A、Y59A均不能在含0.25M NaCl浓度的LBK培养基上生长；多数突变体的Na＋/H＋和Li＋/H＋逆向转运蛋白活性降低，且发生pH偏移。本研究为深入揭示高盐极端微生物适应环境的分子机制奠定了基础。