单核细胞增多李斯特菌InlB、Ami和Auto表面蛋白与人脑微血管内皮细胞相互作用的研究

单核细胞增多李斯特菌(LM)是被WHO列为的4大食源性致病菌之一，是人畜共患李斯特菌病的主要病原菌，LM可穿越宿主血脑屏障引发人和动物的脑炎，病死率可达20-70%，但LM穿越血脑屏障的机制尚未阐明，人脑微血管内皮细胞是构成血脑屏障的主要细胞。在前期研究中，本实验室从临床绵羊脑炎病例中分离到的一株LM，命名为LM90株。本研究拟采用酵母双杂交方法筛选LM90株InlB、Ami和Auto表面蛋白与人脑微血管内皮细胞相互作用的捕获蛋白，并利用免疫共沉淀方法准确验证酵母双杂交筛选到的捕获蛋白，随后采用针对捕获蛋白的RNA干扰技术或添加相应抑制剂的方法，揭示这些捕获蛋白在LM侵染人脑微血管内皮细胞过程中的作用机制，为进一步阐明LM穿越血脑屏障的分子机理以及筛选针对LM的药物靶点提供科学依据。

单核细胞增多李斯特菌(LM)是被 WHO 列为的 四大食源性致病菌之一，是人畜共患李斯特菌病的主要病原菌，LM 可穿越宿主血脑屏障引发人和动物的脑炎，病死率可达 20-70%，但 LM 穿越血脑屏障的机制尚未阐明，人脑微血管内皮细胞是构成血脑屏障的主要细胞。在前期研究中，本实验室从临床绵羊脑炎病例中分离到的一株 LM，命名为 LM90 株。项目利用LM90 株完成了对小鼠血脑屏障功能的影响；对人／鼠脑微血管内皮细胞黏附、侵袭及胞内增殖的测定；构建了LM90侵染鼠/人脑微血管内皮细胞cDNA文库；利用分离泛素化酵母双杂交系统筛选了与LM90InlC和Ami相互作用的捕获蛋白。研究结果表明LM90 人工感染小鼠会提高小鼠血脑屏障通透性，透射电镜下脑血管内皮细胞吞噬小泡明显增加,部分紧密连接明显松散，星形胶质细胞足突出现明显异常，大量神经细胞和胶质细胞坏死、崩解，脑组织中大量的小胶质细胞出现；LM90对不同脑微血管内皮细胞的粘附和侵袭能力不同，并且在其中增殖的速率存在差异，提示可能具有宿主特异性。构建了1.2×105个转化子的LM90侵染鼠脑微血管内皮细胞cDNA文库，阳性重组率为97.92%，0.5kb以上片段约占93.75%，测序基因功能涉及钙离子结合、受体信号激活等；构建了1.03×105个转化子的LM90侵染人脑微血管内皮细胞 cDNA文库，阳性重组率为87.5%，0.5kb以上片段约占78.57%，测序基因功能包含mRNA 结合分子、骨架系统发育等；筛选到与InlC相互作用的假定捕获蛋白基因6个，与Ami相互作用的假定捕获蛋白基因4个。为进一步阐明 LM 穿越血脑屏障的分子机理以及筛选针对 LM 的药物靶点提供科学依据。