LIPI-4介导单核细胞增生性李斯特菌在脑微血管内皮细胞中增殖的分子机制研究

Listeria monocytogenes (LM) is one of the most deadly zoonotic foodborne pathogenic bacteria. LM can cause human and animal central nervous system（CNS）infection by cross the blood brain barrier(BBB), but the mechanism enabling LM to cross the BBB remains poorly understood. Recently, pan-genomic analysis of LM and animal experiments showed that LIPI-4 gene cluster was closely related to CNS infection.In this research, LIPI-4 gene deletion mutants will be constructed, brain microvascular endothelial cells (BMEC) will be used as a model of BBB.A LM comparative transcriptome study of proliferation in BMEC will be performed, and LM differentially expressed genes regulated by LIPI-4 will be screened. Q-PCR will be used to detect the differential genes above screened in different types of cells and in different organs of mice infected by LM, and further to screen LM differentially expressed genes in BMEC and brain tissue. On the other hand, the deletion and complementary strains of the differential expression genes encoding unknown function proteins will be constructed. The genes encoding unknown function proteins will be evaluated by means of intracellular proliferation, intercellular transmission and mouse pathogenicity test.This study will elucidate the molecular mechanism of LIPI-4 in the CNS infection of LM and provide a theoretical basis for the study of LM pathogenesis and drug targets.

单核细胞增生性李斯特菌（LM）是最致命人兽共患食源性致病菌之一。LM可以穿越血脑屏障，导致人和动物中枢神经系统感染，但LM穿越血脑屏障的机制仍知之甚少。最近，LM泛基因组学和动物试验表明LM毒力岛4（LIPI-4）与神经系统感染密切相关。本项目拟构建LIPI-4基因缺失株，以脑微血管内皮细胞（BMEC）为血脑屏障模型，进行LM在BMEC中增殖的比较转录组学研究，筛选由LIPI-4调控的LM差异表达基因；并用Q-PCR检测差异基因在LM侵染不同类型细胞和感染小鼠不同器官中的表达水平，进一步筛选在BMEC和脑组织中特异性表达的差异基因；同时对编码未知功能蛋白的差异表达基因，进行缺失株和互补株的构建，通过胞内增殖、胞间传播，小鼠致病性等试验，评价编码未知功能蛋白的基因在LM致病性上的作用。研究将阐明LIPI-4在LM侵袭中枢神经的分子机制，为LM致病机制和药物靶点研究提供理论基础。

单核细胞增生性李斯特菌（LM）是最致命人兽共患食源性致病菌之一。LM可以穿越血脑屏障，导致人和动物中枢神经系统感染，但LM穿越血脑屏障的机制仍知之甚少。最近，LM泛基因组学和动物试验表明LM毒力岛4（LIPI-4）与神经系统感染密切相关。本项目从54株食源性LM中PCR检测5株携带LIPI-4基因，携带率为9.26%；对LIPI-4中EIIC结构域分析表明5株食品源LM LIPI-4均为PTSLac家族，MLST分型5株均为ST87，首次明确LIPI-4不仅仅存在于LM CC4克隆群，同时也存在于ST87型，CC87克隆群。5株LIPI-4携带株LM的小鼠LD50基本一致，107.2-8.6cfu之间，均能形成生物被膜。完成两株LIPI-4携带株LM928（Genbank登录号CP046478，BioProject 编号PRJNA591981）和LM837的全基因组序列测定与分析，比较基因组分析显示：LM928与临床分离株ICDC-LM188一致性较高，LM873与中国临床分离株SHL012和美国造成人李斯特菌病爆发的FSLJ1-194存在较近的亲缘关系，提示LM928和LM873具有感染人的可能性。LM928对鸡胚和雏鸡均有致病性，主要病变集中在肝脏和心脏，提示雏鸡作为实验动物的可能。成功构建了LIPI-4全基因缺失株LM928ΔLIPI-4和互补株CLM928ΔLIPI-4，LM928ΔLIPI-4显著降低了Lm对hCMECs的黏附、侵袭及胞内增殖能力及胞间迁移，但对小鼠毒力有所上升，小鼠肝、脾、脑等脏器载菌量均高于LM928；雏鸡攻毒试验表明LM928ΔLIPI-4对雏鸡具有一定的保护作用。比较转录组学共鉴定出244个差异表达基因，其中最显著的基因为NDRG1。构建了NDRG1过表达及干扰的hCMECs细胞株，证实LIPI-4通过下调NDRG1基因的表达正调控LM在hCMECs细胞的黏附、侵袭及胞内增殖，从而初步揭示LIPI-4 介导LM 中枢神经系统感染的机制，为LM 致病机制和药物靶标的研究提供科学依据。