自噬小体标记蛋白LC3-II荧光衍生物的半合成及调控细胞自噬机理的研究

细胞自吞噬（autophage）对于维持细胞的正常生理功能，细胞内环境的动态平衡及分化与发育具有十分重要的意义,而自噬小体标记蛋白LC3-II则一直被认为是自吞噬发生、发展的生物靶标。本研究拟通过表达蛋白连接技术（Expressed protein ligation）结合生物重组表达与化学合成得到荧光分子修饰的LC3-II蛋白并使用其监控自噬小泡膜生成与融合的过程及研究调控自噬过程的分子动力学机制。具体计划为：(1)以EPL技术为基础，通过表达得到硫脂蛋白并与化学合成的多肽PE连接得到与天然序列完全一致且具有正确结构和功能的LC3-II蛋白；(2) 选取适合的荧光小分子与其连接，得到荧光修饰的LC3-II蛋白，并在体外模拟脂质体的环境中初步验证其功能；(3)通过将荧光标记的LC3-II注射入哺乳动物细胞内监控自噬发生过程中自噬小泡及自噬溶酶体的生成并研究其调控自噬过程的分子动力学机制。

细胞自吞噬（autophage）对于维持细胞的正常生理功能，细胞内环境的动态平衡及分化与发育具有十分重要的意义,而自噬小体标记蛋白LC3-II则一直被认为是自吞噬发生、发展的生物靶标。本项目通过发展新型蛋白质化学合成及标记的方法，成功运用半合成策略得到了具有较高均一性和纯度的荧光标记的LC3-II，为进一步深入研究自噬发生的机理打下基础。具体成果为：一. 运用羟基酸定点嵌入蛋白质的策略发展出新一代蛋白质半合成策略；二. 结合thiol-ene/yne类生物正交反应及非天然氨基酸定点嵌入技术发展出新型蛋白质定点标记及修饰方法；三. 采用光保护的辅助Arg-Tag的策略，通过半合成得到了C端为磷脂肽的极度憎水的细胞自噬蛋白LC3Ⅱ，该蛋白是细胞启动自吞噬过程的标志，具有重要的生物学意义。理、化实验进一步证实了合成蛋白结构与功能的正确性。该方法的建立同时为为难溶性脂蛋白的化学合成提供了一种新思路。