布鲁氏菌LuxS/AI-2型密度感应系统的构建及其调控机制研究

Brucellosis is a zoonotic disease, which becomes much more serious than ever. The LuxS/AI-2 quorum sensing (QS) system involves production of Autoinducer-2 (AI-2) in bacteria. AI-2 plays important roles in regulation physiological function in bacteria. Our previous researches showed that Brucella abortus lacks LuxS/AI-2 quorum sensing, but can utilize exogenous AI-2 from bacteria, which belong to host microbiota. However, the regulation mechanism of LuxS/AI-2 quorum sensing is still not clear in Brucella abortus. This study include: 1) Construction of LuxS/AI-2 quorum sensing system in Brucella abortus. 2) Evaluation the roles of LuxS/AI-2 quorum sensing system in Brucella abortus pathogenicity. 3) Study the regulation mechanism of LuxS/AI-2 quorum sensing system in Brucella abortus. This study will benefit for elucidation regulation mechanism of LuxS/AI-2 quorum sensing system, and also promote future prevention and control strategies against Brucella abortus infection.

布鲁氏菌病是重要的人畜共患病，近年来该病的人、畜疫情在世界范围内持续增长。存在于革兰氏阴性和阳性菌中的LuxS/AI-2型密度感应(Quorum Sensing)系统，可产生用于细菌种间交流的通用信号分子AI-2，AI-2参与对细菌多种功能的调控。申请者前期研究表明，虽然布鲁氏菌不存在该系统，不产生AI-2，但布鲁氏菌在感染宿主的过程中会和宿主体内外的微生物菌群(microbiota)发生相互作用，而菌群中的许多细菌可以产生AI-2，这些AI-2在布鲁氏菌致病过程中的作用目前没有相关研究。因此，本研究通过3方面研究：1)构建布鲁氏菌LuxS/AI-2型密度感应系统；2)评价该系统对布鲁氏菌致病性的影响；3)研究该系统对布鲁氏菌的胞内存活机制、感染细胞凋亡通路和活性氧(ROS)产生的调控机制，阐明该系统在布鲁氏菌感染过程中的作用机制，可为从群体角度研究布鲁氏菌的致病机理和防控技术提供新思路。

本项目通过构建布鲁菌LuxS/AI-2型密度感应系统，开展其对布鲁菌的调控作用研究。本项目发表研究论文17篇，其中SCI论文9篇；获得授权专利1项；在全国性学术会议上作大会报告4次；参加国际会议1次；毕业硕士研究生3名，在读研究生2名，2名博士晋升副研究员，获得上海浦东新区科技进步三等奖1项，2017年入选上海闵行领军人才。完成了项目申请书的研究内容和考核指标,相关研究成果如下:.1）建立了优化了AI-2 检测的方法，对布鲁菌的AI-2检测结果表明，布鲁菌不产生AI-2信号分子，布鲁菌中存在pfs基因和半胱氨酸水解酶SahH基因，但缺少luxS基因，布鲁菌采用的是SahH型甲硫氨酸代谢通路。.2) 构建了用于布鲁菌基因功能研究的pTM系列质粒载体，以本项目构建的pGH-6×His为表达载体，成功构建含禽致病性大肠杆菌luxS基因的互补质粒pGH-luxS，转化布鲁菌后，成功构建了布鲁菌LuxS/AI-2群体感应系统。.3）构建了布鲁菌pfs缺失株，通过转录组测序筛选到受pfs调控的差异基因和非编码RNA（ncRNA），主要参与半胱氨酸、甲硫氨酸代谢通路和氨基酸生物合成通路。.4）对布鲁菌半胱氨酸水解酶SahH在甲硫氨酸循环中的催化活性及其活性位点研究表明，SahH可催化SAH产生同型半胱氨酸，SahH第444位丝氨酸为其可能的磷酸化位点，第337位和338位氨基酸为其活性位点。.5) LuxS/AI-2型群体感应系统对布鲁菌在感染巨噬细胞内存活、ROS产生、炎症因子产生具有重要调控作用。布鲁菌互补外源性的luxS基因后，能显著升高巨噬细胞内的ROS（p<0.05），炎症因子TNF-α和IL-1β的产生水平（p<0.05）。明确了布鲁菌感染巨噬细胞后主要通过激活TLR4，以MyD88依赖的途径发挥抗菌作用；完成了布鲁菌LuxS/AI-2调控通路对小鼠生殖系统的影响研究。.本研究通过开展luxS/AI-2型群体感应系统对布鲁菌调控的研究，可为从细菌群体角度为布鲁菌病防控提供新思路。