三种核桃属植物PIN1靶向抗肿瘤萘醌类成分及作用机制

Phosphorylation of proteins on serine or threonine residues preceding proline is a key signalling mechanism in diverse physiological and pathological processes. Pin1 (peptidyl-prolyl cis/trans isomerase) is the only enzyme known that can isomerise specific Ser/Thr-Pro peptide bonds after phosphorylation and regulate their conformational changes with high efficiency. Pin1 was found to be overexpressed in most prevalently encountered cancers, and it can promote oncogenesis by activating numerous oncogenes or growth enhancers and by inactivating tumour suppressors or growth inhibitors. Considered its important role in oncogenesis, Pin1 is seen as an effective anticancer target by pharmaceutical researchers. There are 5 species and 1 variant of Juglans plants in China, which were used in the folk medicine for the treatment of liver and stomach cancer. Three novel compounds, Jugnaphthoquinone A-C, have been isolated from this plant, which could inhibit cancer cell proliferation and induce cancer cell apoptosis, while did not have much impact on normal cell proliferation. Moreover, Jugnaphthoquinone A-C exhibited significant inhibitory effects on Pin1, with the IC50 4.4, 3.7, 4.6 µM respectively, suggesting that naphthoquinone from Juglans is a potential source of Pin1 inhibitors. The project intends to target Pin1, combining HPLC-MS/MS analysis, to search for novel Pin1 inhibitors with high efficiency and low toxicity from three Juglans plants: J. cathayensis Dode var. formosana (Hayata) A. et R.H.Chang, J. hopeiensis Hu and J. sigillata Dode. The project will also clarify the network control mechanisms on Pin1 of the bioactive naphthoquinones and therefore provide valuable lead compounds with potential R&D value.

人肽脯氨酰顺反异构酶(Pin1)能特异性催化磷酸化的丝/苏-脯氨酸酰胺键顺反异构，改变底物构象，引起生物功能变化。Pin1在多种癌细胞中高表达，并在癌的发生、发展中起重要作用，是抗肿瘤药物研究的新靶标之一。核桃属植物中国有5种和1变种，民间多用于治疗肝癌和胃癌。申请人前期从该属植物野核桃根皮中分离得到3个结构新颖的没食子酸骈萘醌类化合物Jugnaphthoquinone A-C，均能显著诱导多种癌细胞凋亡而对正常细胞影响较小，且对Pin1具有良好的抑制活性，提示该属植物中的萘醌类成分是Pin1抑制剂的潜在来源。本项目拟以Pin1为靶标，结合HPLC-MS/MS分析方法，从核桃属植物华东野核桃、泡核桃和麻核桃中定向寻找高效低毒的新型萘醌类Pin1抑制剂，阐明包括Jugnaphthalenone A-C在内的萘醌类活性成分对Pin1的网络调控机制，为肿瘤靶向药物的研发提供有价值的先导化合物。

由于人口老龄化、环境污染以及不良的生活方式的影响，恶性肿瘤的发病率逐年升高，已经成为我国城乡居民的首要死因。即使在科学技术高度发达的今天, 恶性肿瘤的防治仍然是世界难题。寻找高效、低毒、经济的抗肿瘤药物仍然是现代医学的重要内容。核桃属 (Juglans L.)植物分3组，全世界范围内共有约20种，分布于两半球温、热带区域。我国产2组5种1变种，引入栽培2种，南北普遍分布，民间多用于治疗肝癌和胃癌。该项目对产于我国的麻核桃、泡核桃和华东野核桃三种核桃属植物进行了深入的化学成分分离和结构鉴定，从三种核桃属植物中分离鉴定了319个化合物（含54个新化合物），化合物类型涵盖萘醌、萘酮、三萜、二芳基庚烷、倍半萜、黄酮、木脂素等类型。通过理化常数测定及UV、IR、HRESIMS、1H NMR、13C NMR、DEPT、HSQC、HMBC、1H-1H COSY、NOESY、ECD等波谱数据分析，并结合X-单晶衍射及化学方法确定了所有化合物的化学结构。课题还采用多种活性研究方法对所得到的化合物的抗肿瘤活性及机制进行了系统研究。此外还筛选了部分化合物的免疫抑制、神经保护和抗菌作用等活性。结果显示三种核桃属植物中的萘醌类成分具有最为显著的细胞毒活性，部分三萜类化合物也具有较好的细胞毒活性。利用流式细胞仪结合PI染色的方法分析了2-甲氧基胡桃醌对HepG2细胞细胞周期的影响，利用流式细胞仪结合AnnexinV-FITC/PI染色的方法测试了2-甲氧基胡桃醌诱导HepG2细胞的凋亡率，利用蛋白印记法 (western blot)分析了2-甲氧基胡桃醌对HepG2细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响。实验结果显示，2-甲氧基胡桃醌使HepG2细胞停滞于S期，并能剂量依赖性的诱导HepG2细胞发生凋亡，其诱导凋亡的机制是通过上调HepG2细胞中Bax/Bcl-2的比率、促进细胞色素c向细胞质中的释放、进而活化caspase-9和caspase-3的线粒体途径来实现的。本项目的研究结果提示2-甲氧基胡桃醌在肝癌的治疗方面具有一定的潜力。该项目的研究也为核桃属植物在恶性肿瘤治疗方面的应用提供了理论依据。