斑叶草（苦苣苔科）两侧对称花形成的调控网络研究

As a key innovation in angiosperm evolution, the origin of zygomorphic (bilateral symmetric) flowers has been comprehensively addressed in the classic model system Antirrhinum majus. However, the regulatory pathway underlying floral zygomorphy is still ambiguous outside A. majus. Therefore, selecting a more ancient representative outside the model system will be particularly important to understand the origin and evolution of zygomorphic flowers. This project selects Chirita pumila (Gesneriaceae, one of the most basal groups in Lamiales) as a model to explore the regulatory network underlying zygomorphic flowers by focusing on floral symmetry genes including CYCLOIDEA (CYC), RADIALIS (RAD) and DIVARICATA (DIV). We will first conduct real-time quantitative PCR and RNA in situ hybridization to analyze the expression patterns of these genes. Then, we will survey the function of these genes in floral symmetry establishment by utilizing several kinds of transgenic methods, including over-expression under the control of the CAMV 35S constitutive promoter, gene knock-down by using the chimeric repressor silencing technology (CRES-T), as well as gain-of-function by rescuing the actinomorphic flower mutants. Furthermore, we will perform in vitro electrophoresis mobility shift assays (EMSA) and in vivo chromatin immunoprecipitation (ChIP) to detect the protein–DNA interactions, and perform transient gene expression to analyze the function of related cis-elements in transcription activation or repression. By adopting the above-mentioned methods, this project aims to comprehensively investigate the function and regulatory network of floral symmetry genes in C. pumila. Finally, through comparative analysis between C. pumila and A. majus, we will probe into the origin and evolution of the regulatory network controlling zygomorphic flowers in Lamiales.

两侧对称花的起源是被子植物辐射分化过程中的一个关键创新事件。目前，人们对于花对称性调控通路的认识主要来自于模式植物金鱼草，而花对称性调控网络是如何进化进而产生不同支系的两侧对称花，人们还知之甚少。因此，选择一个更为原始的代表种开展相关研究就显得尤为重要。本项目以苦苣苔科斑叶草作为模式系统，针对花对称性基因CYCLOIDEA（CYC）、RADIALIS（RAD）以及DIVARICATA（DIV）开展一系列研究。我们首先采用实时定量PCR和原位杂交方法分析这些基因的表达模式，然后凭借过量表达、基因敲除、功能互补等转基因技术研究基因的功能，最后通过凝胶阻滞、染色质免疫沉淀以及瞬时基因表达实验探讨基因间的调控关系。通过以上研究，本项目旨在全面揭示斑叶草两侧对称花形成的调控网络。由于斑叶草比金鱼草更为原始，因此，本项目的研究结果将对深入理解唇形目两侧对称花调控网络的起源与演化具有重要意义。

两侧对称花的起源是被子植物辐射分化过程中的一个关键创新事件。在传统模式植物金鱼草中，CYCLOIDEA（CYC）和DICHOTOMA（DICH）共同决定背部花瓣的特征以及背部雄蕊的败育，它们通过直接激活RADIALIS（RAD）而控制背部花瓣特征的形成。RAD蛋白和腹部特征因子DIVARICATA（DIV）具有拮抗作用。然而，花对称性调控网络是如何进化进而产生不同支系的两侧对称花，目前并不清楚。本项目以唇形目基部的苦苣苔科植物斑叶草作为模式系统，以控制花对称性的关键候选基因CpCYC1、CpCYC2、CpRAD、CpDIV为主要研究对象，采用实时定量PCR、RNA-seq、凝胶阻滞以及各种转基因技术（包括过量表达、RNAi、强抑制子敲除、CRISRP/Cas9）开展了基因表达、功能以及调控关系研究。结果表明，两个CYC类基因可以控制与两侧对称花相关一系列形态性状的产生，包括决定背部花瓣的特征，促使背部花冠筒内壁脊状突起的形成，抑制背/侧部雄蕊的发育，以及决定花瓣和雄蕊的数目。此外，CpCYC1、CpCYC2还表现出很大程度的表达和功能分化：前者在背部花瓣以及背/侧部雄蕊上均有表达，而后者仅在背/侧部雄蕊上表达；CpCYC2在抑制雄蕊发育和促进花冠筒内壁脊状突起形成方面具有更加显著的作用，并且能够决定花瓣的形态以及花朵的朝向。CpRAD具有令人意外的腹部表达和作用模式，并且与CpCYC1和CpCYC2具有复杂的调控关系。CpDIV的表达量下调增加了花冠筒内壁脊状突起的数目。但是，CpRAD和CpDIV的表达量上调或下调均不能够改变花的整体对称性。此外，我们还筛选到可能参与花对称性控制的两个新基因。总之，在斑叶草两侧对称花的形成过程中，CpCYC1、CpCYC2毫无疑问起着关键性的决定作用，而CpRAD和CpDIV可能仅起着辅助性的次要作用。结合斑叶草和金鱼草的系统位置，以上研究结果暗示CYC类基因在唇形目最初分化的类群中就已经被招募到两侧对称花的形态建成中，而CYC类对RAD类基因的激活作用以及RAD类和DIV类基因间的拮抗关系是在更加进化的类群中才逐渐被招募。以上结果对深入理解唇形目两侧对称花调控网络的起源与演化具有重要意义。