基于ERF转录因子调控稗草抗二氯喹啉酸和五氟磺草胺的分子机理

The evolution of barnyardgrass (Echinochloa crus-galli) resistant to multiple herbicides will seriously threat rice production in China. In our previous work, we found that gene and protein expressions of ethylene-responsive factor (ERF) had significant differences between multiple-resistant and susceptible biotypes of E. crus-galli and preliminary showed that ERF played an important function in herbicide resistance. Therefore, using multi-herbicide resistant (quinclorac and penoxsulam), single herbicide resistant (quinclorac or penoxsulam) and susceptible barnyardgrass biotypes as materials, the objectives of this study will be to (1) identify ERF genes from E. crus-galli and determine gene function domain and subfamily class using phylogenetic tree analysis; (2) compare temporal and spatial variation in ERF gene expression under herbicide stress in E. crus-galli using quantitative real-time PCR method; (3) determine ERF biological functions through prokaryotic expression, subcellular localization and transcriptional activation analysis; (4) demonstrate ERF gene functions in transgenic tobacco and unravel the responsive genes related to hormone signaling pathways under the control of ERF transcription factor. In general, these above results will explore the new mechanism of barnyardgrass resistant to multiple-herbicide and will provide a theoretical basis for making a new strategy to control weeds safety and ensure crops high quality in farmland systems.

抗性稗草（Echinochloa crus-galli）种群发展将严重威胁我国水稻的安全生产，前期研究发现乙烯应答转录因子ERF基因及其蛋白表达量在稗草多抗性生物型与敏感型间存在显著性差异，初步表明ERF在稗草抵抗除草剂胁迫中发挥着重要的功能。申请者拟以稗草多抗性（兼抗二氯喹啉酸和五氟磺草胺）、单抗性（二氯喹啉酸或五氟磺草胺）和敏感生物型为研究材料，首先克隆稗草的ERF基因，并确定其蛋白功能域、系统发生树及其所属的亚家族类。在此基础上，利用实时荧光定量PCR技术分析供试稗草ERF基因在供试药剂胁迫下的时空表达特性差异；并采用原核表达、亚细胞定位和转录激活研究方法探讨不同来源ERF蛋白的生物学功能差异性；通过转基因技术验证ERF在转基因烟草中的表达功能，并捕获ERF参与的信号转导相关蛋白，最终揭示ERF转录因子调控杂草产生抗药性的新机制，为挖掘农田杂草绿色治理的新途径提供理论依据。

稗草（Echinochloa spp.）是严重威胁我国水稻的安全生产的恶性杂草之一，前期研究发现乙烯应答转录因子ERF基因及其蛋白表达量在稗草多抗性生物型与敏感型间存在显著性差异，初步表明ERF在稗草抵抗除草剂胁迫中发挥着重要的功能。本项目团队以稗草多抗性（兼抗二氯喹啉酸和五氟磺草胺）、单抗性（二氯喹啉酸或五氟磺草胺）和敏感生物型为研究材料，明确了抗性生物型稗草对二氯喹啉酸和五氟磺草胺均产生了高水平的抗药性。不同世代的二氯喹啉酸抗性稗草种群随着世代的增加，抗性指数也随之增加。明确了ALS基因的574氨基酸突变导致稗草多抗性生物型对五氟磺草胺产生多抗性。并从稗草中克隆了4个ERF基因家族成员—ERF1a、ERF1b、ERF2和ERF3，实时荧光定量PCR（qPCR）分析了ERF基因成员、乙烯生物合成途径关键基因（ACC氧化酶ACO和ACC合成酶ACS）和β-氰丙氨酸合酶（β-CAS）基因在稗草多抗性生物型和单抗二氯喹啉酸生物型在二氯喹啉酸处理前后的基因表达差异性，明确了ERF1b基因在二氯喹啉酸处理下转录激活了敏感性稗草中的乙烯生物合成途径；亚细胞定位和转录激活试验结果表明ERF1b蛋白定位在烟草叶片的细胞核中，并在酵母中具有转录激活功能；最后通过转基因技术得到转基因拟南芥T2代植株。进一步发现，卡方测验结果表明孔雀稗对二氯喹啉酸的抗性受单个显性基因控制，与二氯喹啉酸的吸收、转运阻隔及代谢降解和β-CAS解毒机制无关，可能机理是ERF转录激活乙烯生物合成途径的上游基因（如生长素受体）突变所导致。本项目揭示了ERF基因参与调控乙烯生物合成途径，为深入揭示稗草对二氯喹啉酸的靶标突变机制提供了新切入点，为挖掘农田杂草绿色治理的新途径提供理论依据。本项目的阶段性成果发表标注的研究论文3篇，获得2020年度国家科技进步奖二等奖、2018年湖南省科技进步奖一等奖、2020年度江苏省农业技术推广奖一等奖各1项。