基于小胶质细胞信号传导通路整合作用的栀子、三七有效组分配伍保护神经元的机制研究

小胶质细胞的稳定是中风后神经元生存的重要因素，激活的小胶质细胞释放神经毒性和神经保护性因子的平衡是其稳态的关键。本研究根据中药有效组分配伍整体调节的药效特征，结合对细胞信号转导通路的认识，提出基于小胶质细胞信号传导通路整合作用的栀子、三七有效组分配伍保护神经元的研究思路。以小胶质细胞和神经元为研究对象，观察有效组分单独或配伍使用干预后的小胶质细胞条件培养液对神经元的形态、功能、电活动等方面的影响；利用TGF-β和TNF-α两种基因芯片，筛选有效组分单独或配伍使用对小胶质细胞两条通路上基因表达的差异，分析差异基因的交互关系；根据相关信号所对应的生物学效应，利用RT-PCR、免疫印迹技术，结合信号通路阻断剂或激活剂，在小胶质细胞或神经元上印证，阐释中药有效组分配伍是如何发挥对不同信号转导通路的整合调节来达到稳定小胶质细胞，从而保护神经元的目的。在分子层面诠释中药有效组分配伍规律和药效机制问题。

缺血性中风给社会和家庭带来了沉重的负担，阐释中药有效组分治疗该类疾病的配伍规律和药效机制是该领域的重要科学命题。缺氧激活的小胶质细胞可同时分泌促炎因子和抑炎因子，本课题设想：以TNF-α和TGF-β为促炎因子和抗炎因子的代表，以治疗中风常用药栀子和三七的有效组分为干预手段，通过二者配伍有侧重地调节小胶质细胞TNF-α和TGF-β的分泌，使信号通路获得整合，令小胶质细胞释放神经毒性因子与释放神经保护性因子之间的回复平衡，从而为神经元存活创造一个良好微环境。主要研究成果：第一部分：栀子、三七有效组分配伍对缺氧诱导损伤的小胶质细胞炎症因子分泌的平衡调节作用。通过检测不同剂量的栀子和三七有效组分（栀子苷和人参皂苷Rg1）及其配伍（即通络救脑注射液）对小胶质细胞CCK-8、NO的影响，发现通络救脑注射液、栀子苷和人参皂苷Rg1最佳浓度分别为40 µg/mL、25 µg/mL和5 µg/mL，并发现栀子苷的作用侧重于对促炎因子的抑制，人参皂苷Rg1的作用侧重于对抑炎因子的促进，配伍二者使用可同时阻抑促炎因子和促进抑炎因子，使二者回复平衡。第二部分：栀子和三七有效组分干预后的小胶质细胞条件培养液对神经元的影响。通络救脑注射液作用后的小胶质细胞条件液可通过增加缺氧损伤神经元的活性而降低其LDH漏出率，增加线粒体膜电位，改善线粒体的超微结构，其作用优于栀子苷或人参皂苷Rg1单独处理过的小胶质细胞条件液。栀子苷和人参皂苷Rg1处理过的小胶质细胞条件液可分别降低神经元NMDAR1和Caspase-3的表达，通络救脑注射液作用后的小胶质细胞条件液可同时降低二者的表达。第三部分：基因测序法观察栀子和三七组分配伍对小胶质细胞基因组学的影响，明确二者对小胶质细胞的整合作用。对TNF-α和TGF-β信号通路上基因进行cluster分析后发现，栀子苷主要调节了TNF-α信号通路，人参皂苷Rg1主要调节了TGF-β信号通路，配伍使用对两条信号通路同时有干预作用。栀子苷、人参皂苷Rg1、二者配伍可使小胶质细胞产生应答的共同通路且与小胶质细胞功能相关的是Fc受体介导的吞噬通路。而FcγR对TNF-α和TGF-β的表达同时具有调节作用，因此我们认为栀子、三七有效组分通过对FcγR有侧重的调节，从而达到对TNF-α和TGF-β信号通路的整合，令激活的小胶质细胞处于稳态，利于神经元的生存。