自噬性溶酶体再生机制的研究

Autophagy is a lysosome-based degradation pathway. During autophagy, lysosomes fuse with autophagosomes to form autolysosomes. Following starvation-induced autophagy, nascent lysosomes are formed from autolysosomal membranes through an evolutionarily conserved cellular process, autophagic lysosome reformation (ALR), which is essential for maintaining lysosome homeostasis (Yu et al, Nature, 2010). During ALR, tubular structure (reformation tubules) extended from autolysosome, and nascent lysosomes are formed by fission of reformation tubules. Combining a screen of candidates identified through proteomic analysis of purified ALR tubules, and large-scale RNAi knockdown, we unveiled a tightly regulated molecular pathway that controls lysosome homeostasis (Rong et al, PNAS, 2011, Rong et al, Nature Cell Biology, 2012). In this project, We successfully set up an in vitro reconstitution system in which the tabulation of autolysosome is recapitulated. We will take advantage of this system to investigate the molecular mechanisms of ALR, including molecular mechanism governing autolysosome tabulation, cargo sorting and fission of nascent lysosome.

自吞噬（autophagy）是细胞内一种溶酶体依赖性的降解途径。自噬的细胞生物学过程可以概括为前自噬体的装配、自噬体膜的延伸、自噬体的形成、自噬体同溶酶体的融合、 自噬性溶酶体再生等5个步骤。 其中，自噬性溶酶体再生由申请人 发现并提出，在这一过程中，由自噬溶酶体膜形成的管状结构从 自噬溶酶体上伸出， 新溶酶体从这一管状结构上断裂形成。申请人通过大规模筛选工作鉴定了参与自噬性溶酶体再生的重要因子。在本项目中，我们基于前期研究工作，利用纯化的参与自噬性溶酶体再生的蛋白、小分子，人工膜或从细胞中纯化出的膜结构，在 体外重构系统中重构了自噬性溶酶体的出管过程，我们计划利用此系统，结合传统的细胞生物学手段， 深入研究自噬性溶酶体 的出管，货物选择，新溶酶体从自噬性溶酶体再生管上的断裂等过程的分子机制，体外重构在更可控的体系中研究生物学问题，能够更准确和深人和准确地研究自噬性溶酶体再生的分子机制 。

自噬是真核细胞内一种依赖溶酶体的降解途径。它在衰老、凋亡以及诸多疾病中均发挥重要作用。自噬通常以基底水平发生于大多数组织与细胞中，负责清除受损的细胞器或错误折叠的蛋白等。一旦细胞受到环境压力，自噬会被迅速诱导起来。在自噬过程中，吞噬泡会在被降解的物质周围延伸，随后闭合形成自噬体。自噬体会与溶酶体融合，形成自噬溶酶体。当前的研究主要关注自噬体的形成以及前期阶段。然而，自噬溶酶体之后的过程研究却非常少见。我们实验室一直致力于自噬晚期过程的研究。我们发现在自噬溶酶体再生过程中，自噬溶酶体会伸出一个管状结构，随后溶酶体成分被招募到自噬溶酶体管上。自噬溶酶体管状结构顶端会断裂形成小的原溶酶体，原溶酶体会进一步驯化成功能性的溶酶体。我们将这一过程称之为自噬溶酶体再生过程，它在维持细胞内溶酶体稳态中起了重要作用。在自噬溶酶体再生中，一个明显的步骤是管状自噬溶酶体的生成。到目前为止，管状自噬溶酶体生成的机制还不清楚。在本论文中，我们采用体内实验和体外重构实验两种方式相结合来研究自噬溶酶体管状结构生成的分子机制。研究发现，KIF5B是影响自噬溶酶体出管的重要蛋白质。同时，我们发现KIF5B能与PtdIns(4,5)P2相互作用。KIF5B可以通过与PtdIns(4,5)P2相互作用而被招募到PtdIns(4,5)P2微区。PtdIns(4,5)P2微区的形成受网格蛋白调控，进而影响到KIF5B的定位。最后，我们发现KIF5B定位到PtdIns(4,5)P2微区是自噬溶酶体出管所必须的。我们的研究发现了一个新的调控机制，即网格蛋白调控自噬溶酶体膜上PtdIns(4,5)P2聚集成微区，继而招募KIF5B定位到PtdIns(4,5)P2微区处，随后促进了自噬溶酶体管状结构的生成。