凝血因子Ⅷ Trp1707Ser突变相关抑制物的作用机制研究

血友病A由F8基因突变所致，替代治疗是目前最有效的治疗途径。但20%-50%的患者在替代治疗过程中产生针对FⅧ的抑制物，严重影响疗效。F8基因错义突变所导致的抑制物作用机制的研究对阐明FⅧ结构与功能及相关抑制物生成的分子机制具重要意义，并可为制备低免疫原性的重组FⅧ提供理论依据。本项目拟对一种F8基因Trp1707Ser突变所致的高滴度FⅧ抑制物进行研究。通过体外表达野生型及各种突变型FⅧ蛋白，以斯卡查德分析法、改良凝血酶法等探讨Trp1707Ser突变对VWF结合作用及凝血酶裂解作用的影响，阐明Trp1707在FⅧ结构与功能中的作用。体外分离、纯化患者抑制物，以酶联免疫学法、发色底物法等技术，通过抑制物对FⅧ与VWF、磷脂结合作用及对凝血酶裂解活化FⅧ作用的研究，阐明Trp1707Ser突变所致抑制物灭活FⅧ活性的分子机制。

血友病A由F8基因突变所致，但20%-50%的患者产生抑制物。F8基因错义突变所导致的抑制物作用机制的研究对阐明FⅧ结构与功能及相关抑制物生成的分子机制具重要意义，并可为制备低免疫原性的重组FⅧ提供理论依据。.本项目对FVIII Trp1707Ser突变所致的抑制物进行研究。我们检测出该抑制物针对的位点位于FVIII重链A2亚基和轻链C2亚基。检测显示VWF可减弱抑制物的抑制作用。构建野生型B亚基缺失、Trp1707Ser、Trp1707Ala、Trp1707Glu及Trp1707Arg突变型FVIII真核表达质粒，检测显示1707位点突变使FVIII蛋白分泌下降，表明1707位点对FVIII在胞内的修饰具一定作用。ELISA检测显示Trp1707Ser突变蛋白对VWF的结合作用弱于野生型蛋白。进一步对rFⅧLC蛋白原核表达，构建野生型及突变型rFⅧLC表达质粒PET-42a-GST-WT(LC)和PET-42a-GST-W1707S(LC)，经蛋白表达、包涵体变性、复性，GST柱蛋白纯化，蛋白浓缩等过程获得目的蛋白。运用Biacore3000表面等离子共振仪对rFVIII、野生型及突变型FVIII LC与VWF的结合进行检测。结果显示3个蛋白对VWF呈浓度依赖性结合。rFⅧ与VWF结合力高于野生型及突变型FVIIILC，后两者与VWF结合无明显差异，表明FVIII与VWF的结合与FVIII完整性及构象密切相关。.综上所述，本项目通过体外分离纯化抑制物，以ELISA、发色底物法、westerblot法等技术，初步探讨了Trp1707Ser突变所致抑制物结合FⅧ的分子机制，发现该突变相关抑制物主要针对重链A2亚基和轻链C2亚基，VWF可减弱抑制物的抑制作用。体外表达野生型及各突变型FVIII蛋白及FⅧ(WT-LC)及FⅧ(W1707S-LC)原核蛋白初步阐明Trp1707的突变影响FⅧ的结构及分泌并影响VWF与FVIII的结合，提示FVIII与VWF的结合与FVIII完整性及构象密切相关。本课题对FVIII Trp1707Ser突变相关抑制物及蛋白功能的初步阐明为进一步对抑制物作用机制的研究奠定了基础，也为探索重组FⅧ的结构修饰以制备低免疫原性的重组FVIII提供新思路，对减少血友病替代治疗中抑制物的产生具重要意义。