趋化因子CXCL9抗体促进化疗后骨髓修复的药效学及其调控造血的分子机理研究

Chemotherapy-induced bone marrow (BM) damage is an important limiting factor for clinical tumor therapy. The purpose of this project is to develop a new biotech drug for therapeutic or adjuvant treatment of this side effect of chemotherapy. With a cDNA microarray, we have found previously that hematopoietic negatively regulating chemokine CXCL9 was extremely activated in the chemotherapy-treated mouse BM, and demonstrated that the high levels of CXCL9 significantly inhibited the repair of damaged BM after chemotherapy. In combination with the rise of the monoclonal antibody drugs, we propose that CXCL9 monoclonal antibodies could be used to neutralize the high-level endogenous CXCL9, hereby clearing the hematopoietic inhibitory effect of CXCL9, promoting BM repair after chemotherapy. We have completed three national grants in the research of CXCL9 regulating hematopoiesis, successfully prepared the bio-active human CXCL9 and mouse CXCL9 proteins, produced rat-anti-mouse CXCL9 polyclonal antibody, and studied the regulation of CXCL9 on hematopoietic stem cells as well as on the hematopoietic microenvironments. With this project, we will further explore the molecular biological mechanisms that underlie the role of CXCL9 in hematopoiesis, possibly through the Erk1/2 and p70S6K pathways in CXCL9-stimulated mesenchymal stroma cells. Our work would definetely provide a solid and reliable theoretical basis for the development of CXCL9 monoclonal antibody drug in the treatment of chemotherapy-induced BM suppressive side effects.

化疗导致的骨髓损伤是临床肿瘤治疗的重要限制因素,本项目的宗旨，是开发治疗或辅助治疗该副作用的新型生物技术药物。我们前期利用化疗后骨髓细胞基因芯片研究，发现具有造血负调控作用的趋化因子CXCL9在化疗后骨髓被异常高表达，并证实高水平CXCL9对化疗后骨髓损伤修复具有明显的抑制作用。在此基础上，结合目前单克隆抗体药物的兴起，我们提出了利用CXCL9单克隆抗体对化疗后高表达的内源性CXCL9进行中和，从而清除其造血抑制作用，促进骨髓修复的研究设想。我们前期已经完成三个国家级课题，成功制备了人和小鼠CXCL9蛋白以及抗小鼠CXCL9多克隆抗体，并从造血干细胞本身及造血微环境两个方面对CXCL9调控造血进行了初步探讨。本项目中我们将从CXCL9激活骨髓基质细胞Erk1/2和p70S6K两条通路入手，深入研究CXCL9作用的分子生物学机制，为CXCL9单抗治疗化疗骨髓抑制副作用提供扎实可靠的理论依据。

在本项目的资助下，我们首先在小鼠化疗模型上证实了抗CXCL9单克隆抗体的骨髓抑制治疗作用，并分离培养造血干细胞（HSC）和间充质干细胞（MSC），进行了CXCL9的造血调控作用机制研究。本研究的重点在于阐明CXCL9作用于MSC细胞Erk1/2 和p70S6K 两条通路，确定相关效应分子，从而影响HSC增殖，为抗CXCL9单克隆抗体的药效学作用提供理论支撑。.前期工作发现小鼠及人化疗后会应激产生高水平的内源性CXCL9，而CXCL9具有造血抑制作用，因此对造血系统的恢复不利，应用抗体等CXCL9作用的拮抗剂能够清除CXCL9的造血抑制作用，从而促进化疗后骨髓的修复。本项目研究证实，在单次大剂量5-氟尿嘧啶（5-FU）化疗模型上，抗CXCL9单克隆抗体能够显著促进骨髓修复，提高小鼠存活率。在多轮中低剂量化疗中，抗CXCL9单克隆抗体同样能够维持骨髓修复处于较高的水平，较G-CSF阳性对照能够减缓造血干/祖细胞的耗竭，因此，抗CXCL9单克隆抗体作为新的化疗骨髓抑制治疗药物具有确切的应用前景。.我们前期研究已阐明CXCL9对HSC的直接作用通过抑制STAT5磷酸化进行，但其通过MSC作用于HSC的间接作用不明确。本项目实施过程中，我们研究了p70S6K/mTOR通路磷酸化，发现CXCL9能够刺激p70S6K的磷酸化，进而抑制MSC分泌TGF-β。进一步研究发现，CXCL9在上皮细胞存在不同的作用方式，能够通过刺激小肠上皮细胞p70S6K的磷酸化从而增加释放TGF-β，对上皮干细胞增殖起到抑制作用，因此，CXCL9对TGF-β释放从而影响组织干/祖细胞的增殖存在多面性。另一方面，CXCL9能够激活Erk通路下游的STAT1磷酸化，并进一步影响iNOS的合成，从而使间充质干细胞作用于造血干/祖细胞的增殖调控。本部分研究结果已有1篇SCI文章发表在肿瘤学研究领域专业杂志Journal of Cancer Research and Clinical Oncology（Lu H，et al. 2015），另有1篇论文在撰写中。.为更好地开发基于CXCL9造血干细胞调控作用的新型药物，我们在本项目的资助下进一步优化重组CXCL9蛋白及CXCL9中和抗体的生产工艺，在大肠杆菌系统建立了新型可溶性自剪切标签Zbasic-∆I-CM，并将其应用到重组蛋白或抗体片段的制备中。在单抗制备方面