miR-17-92 在大鼠颅骨缝发育和融合中的调控及机制研究

Cranial sutures function as major growth sites of the mammalian craniofacial development. Abnormal suture development and fusion can evolve several developmental malformations, such as craniosynostosis. The mechanisms involved in normal cranial suture development and obliteration as well as in the pathophysiology of craniosynostosis are not well understood. It has been admitted that Transforming growth factorβ (TGFβ) is a key regulators of suture development. In our previous work, we proved that Smad7, intracellular mediators of canonical TGFβ signalin, plays an important role in maintaining suture patency by suppressing canonical TGFβ signaling during suture development. MicroRNAs are a new class of small non-coding RNA molecules that function as negative post-transcriptional gene regulators. Recent research has demonstrated that miR-17-92 cluster which target Smad7 critically regulates osteoblast proliferation and differentiation.Therefore, we propose the following hypothesis, as the regulatory factor of smad7, miR-17-92 cluster may play a important role in suture development. RNAi, pre-microRNA and luciferase assay will be used to screen the key MicroRNAs involved in cranial suture development and find the regulation and mechanism of miR-17-92 in cranial suture development. The result will provide scientific basis for expounding the molecule mechanisms of suture development and prevention and cure the malformation of craniofacial development.

颅骨缝是哺乳动物颅颌面发育的主要生长区域。关于颅骨缝正常发育和融合以及颅缝早闭的病理生理学机制目前仍不清楚。TGFβ已经被公认是一个在颅骨缝的发育和融合中起关键作用的调控因子。本课题组前期研究证实Smad7通过抑制经典TGFβ信号通路来维持骨缝的开放。MicroRNAs是新发现的在转录后对基因起负向调节作用的一类非编码的小分子RNA。近期的研究发现miRNA-17-92基因簇与人类骨骼发育缺陷相关，且Smad7是其重要靶基因之一。因此我们提出以下假说，作为Smad7重要的调控分子，miRNA-17-92基因簇可能在颅骨缝的发育和融合中扮演重要角色。本研究拟采用RNA干扰、pre-microRNA 以及荧光素酶报告基因实验等分子生物学技术来研究miR-17-92基因簇在颅骨缝发育中的调控机制。研究结果将为揭示颅颌面生长发育的分子生物学基础以及对颅面发育异常导致的畸形的防治提供科学依据。

本课题首次筛选出了在大鼠颅骨缝发育和融合过程中起关键作用的miRNA。在颅骨缝发育和融合的关键时期（N10-21），我们使用实时荧光定量 RT-PCR（Real-time PCR）检测 miR-17-92 基因簇(包括 miR-17-5p，miR-17-3p，miR-18，miR-19a, miR-20，miR-19b 和 miR-92a)在开放的冠状缝（CS）和融合的后额缝（PFS）中的 mRNA 表达。比较在骨缝融合的关键期，各个miR-17-92 基因簇在冠状缝和后额缝中的表达差异。我们的结果显示，miR-17-5p在融合的后额缝（PFS）和不融合的冠状缝（CS）中的表达差异较大，在CS中表达明显降低。在后续实验中，我们在动物模型上利用agomir增强miR-17-5p在CS中的表达，我们观察到在miR-17-5p表达上升的实验组中CS的骨缝宽度明显比对照组小，并产生了部分的融合，而Smad7的表达明显降低，p-smad2/3的表达增加，骨缝细胞凋亡降低，增殖升高；我们同时还检测了相关信号通路的表达。我们的结果显示，在大鼠颅骨缝的发育和融合过程中，miR-17-5p起着关键的作用，其机制可能是通过对其靶基因Smad7的调节，从而调节TGF-β/Smad信号通路在骨缝融合中的作用，同时也改变了骨缝细胞的增殖和凋亡，而ERK、BMP信号通路可能参与了这个过程。研究结果将为揭示颅颌面生长发育的分子生物学基础以及对颅面发育异常导致的畸形的防治提供科学依据。