小鼠附睾piRNA时空表达特性及其生物学功能研究

Epididymis plays a crucial role in regulating the development of sperm motility and fertilizing capacity. Piwi-interacting RNA (piRNA) are small RNA abundant in the germline across animal species, which bind specifically to the piwi proteins of the Argonaute families, and functioned in the maintenance of germline DNA integrity, silencing of transposon transcription, translation suppression, epigenetic regulation and gametogenesis. Recently, some of the groups independently showed that widespread expression of piRNA in somatic tissues and cancer cells. Especially, in macaque epididymis, pilRNA(piRNA like small RNA) abundance was compatible with pilRNA abundance in the germline, indicating that piRNA or pilRNA may play important roles in the epididymis. To explore the biological functions of piRNA in mouse epididymis. By using high throughput deep sequencing technology and bioinformatics strategy, spatio-temporal expression patterns of piRNA in epididymis will be first characterized. And androgen response piRNA will also be identificated. Secondly, the expression patterns of piRNA pathway genes in mouse epididymis will be characterized. The last but the most important is candidate piRNA will be chosen to explore its function in epididymis cell lines and/or animal model. Our research will provide new knowledge on the functions of small RNAs in epididymal gene regulation.

附睾对精子成熟起了关键性作用，精子经过附睾后才具备运动和受精能力。piRNA是新发现的一类非编码小RNA 分子，其特异性地同Argonaute 蛋白家族中的Piwi 亚家族蛋白结合。它对维持生殖细胞基因组稳定性，促进转座子沉默、抑制翻译，执行表观遗传调控和配子发生等有作用。然而，最新的研究指出，除了生殖细胞外，piRNA在不同类型体细胞和癌细胞中均表达。值得一提的是，猕猴附睾中pilRNA丰度与生殖细胞中的相当，暗示piRNA在附睾中可能有用。为了揭示其在附睾中的作用，我们将采用高通量测序和生物信息学相结合的策略，首次系统性构建小鼠附睾piRNA的时空表达谱，寻找雄激素调控piRNA。其次，我们将对附睾中piRNA通路相关基因进行表达鉴定，并筛选潜在附睾特异相互作用蛋白。最后，候选的piRNA将深入发掘其在附睾中的生物学功能。本研究将为揭示小RNA分子参与调控的附睾基因表达提供新的素材。

piRNA是一类小分子非编码RNA分子，其主要在生殖腺中被发现，可与Piwi蛋白结合形成piRNA复合物，与RNA沉默作用有关，特别是参与精子发生。附睾对精子成熟起了关键性作用，精子经过附睾后才具备运动和受精能力。为了探明附睾中piRNA的种类、生成机制和对精子成熟的作用，通过实施本项目，获得了如下主要结果：1）利用二代高通量测序技术和生物信息学分析发现小鼠附睾中存在大量piRNA，呈现附睾区段富集或特异性表达，这些piRNA预测来自不同piRNA簇，长度为24~32 nt，其5’端具有强烈的尿嘧啶倾向性。利用阉割和雄激素补充动物模型检测发现，附睾中的piRNA表达不受雄激素含量变化影响。比较两个不同年龄阶段小鼠附睾piRNA表达谱，发现其表达丰度在13月龄中含量显著高于2月龄。2）piwil1在附睾的起始部和头部相对高表达，piwil2在附睾头和体部相对高表达；检测发现piwil4在附睾中的表达显著高于全身其它组织，且在附睾头和尾部相对高表达；在不同的发育阶段中，piwil2表达上调，而piwil4表达不变；Mael和Tdrd1在附睾中也均有表达，推测附睾中piRNA的生成可能主要受piwil4调控，但piwil2可能与老年小鼠附睾piRNA生成有关。3）检测附睾敲除piwil4小鼠模型，发现在出生30天的附睾头部主细胞中特异敲除该基因，雄性小鼠的生育能力和精子获能不受影响。4）GPX5主要由附睾头上皮细胞合成和分泌，在附睾管腔中与精子结合，为精子功能的正常发挥提供保护。Gpx5 敲除后的老年小鼠附睾上皮细胞中piRNA显著减少，其中piwil2，Mael和Tdrd1的表达显著降低，而piwil4表达不变，推测Gpx5可能通过调控piwil2信号通路促进老年小鼠附睾中piRNA的生成。总之，附睾上皮细胞中存在大量piRNA, 其生成机制与生殖细胞不同，特别发现Gpx5可能间接参与附睾piRNA的加工成熟，这些piRNA可能会保护精子细胞抵抗氧化应激从而有助于提高精子质量。