RNA连接酶RtcB在小鼠卵母细胞发育和减数分裂过程中的功能研究

Recently, it has been reported the presence of introns in 5%–10% of fully transcribed RNAs, which can be deleted by alternative splicing (AS). These retention introns are named exitrons. The exitrons are removed by AS. This is thought to control developmental transitions or stress responses at particular stages, cell types, or conditions. There is abundant maternal mRNA in oocytes. However, it is not clear whether this mechanism exists in oocytes. RNA ligase is essential for mRNA editing. RtcB is the only known RNA ligase in metazoans. We found that RtcB was highly expressed in mouse oocytes. Thus, RtcB is a potent candidate for the splicing of the introns of the maternal mRNA in the oocytes. The project aims to construct the RtcB oocyte target knockout mouse model and studies its role in primordial follicle maintenance, oocyte development and meiosis by knockout murine fertility test and phenotypic analysis. The study will help to reveal the mechanism of oocyte development and maturation, and it is of great significance for the protection of female reproduction and the improvement of assisted reproductive technology.

最近报道，进入细胞质的mRNA中，尚有5-10%保留着内含子, 被称为外显内含子，由可变剪接将其删除；在某些特定条件或特殊细胞中，作为控制细胞分化和应激反应的一种快速基因表达应答机制。卵母细胞中存在大量的母源mRNA，是否存在这种机制尚不清楚。RNA连接酶是mRNA编辑中必不可少的成员，RtcB是目前后生动物中唯一已知的一种RNA连接酶。因此，对于卵细胞中母源mRNA外显内含子的剪接，RtcB是一个强有力的候选者。目前对RtcB的生理功能知之甚少。我们发现RtcB在小鼠卵母细胞中高度表达。本项目拟构建RtcB卵母细胞靶向敲除小鼠模型，并通过敲除鼠的生殖力检测和表型分析，研究其在原始卵泡维持、卵母细胞发育及减数分裂中的作用。项目的完成将有助于揭示卵母细胞发育和成熟的调控机制，对保护雌性生殖力及改进辅助生殖技术具有重大指导意义。

RTCB是一种非经典的RNA连接酶，能够对一些tRNA和未折叠蛋白反应中的mRNA剪切后的两个半分子进行连接，从而调节一些特殊的生理过程。本项目通过条件性基因敲除技术，特异性地在原始卵泡中对卵母细胞的Rtcb基因进行敲除，主要研究RTCB在卵巢及各级卵泡发育、卵母细胞减数分裂、早期胚胎发育、合子基因组激活（ZGA）等过程中的重要功能。研究结果表明，Rtcb mRNA在卵母细胞各时期表达量变化不大，在2-4 cell时期表达量明显增加，在桑椹胚时期表达量最高。RTCB蛋白水平从GV到MI期无明显变化，在MII期明显增加。通过基因组和蛋白水平检测确定RtcB基因在卵母细胞中完全被敲除。通过长达7个月的生殖力检测发现，雌性敲除鼠完全不育。7月和10周的敲除鼠卵巢明显变小，各级卵泡中无卵母细胞存在，卵巢出现显著的早衰。4周和6周的敲除鼠卵巢大小、形态和各级卵泡数目与野生型相比并无明显异常，但其中的卵母细胞质量较差，许多无法发育到MII期，即使少数能排出MII期卵母细胞，但与精子结合后仍然无法顺利的完成早期胚胎的发育。将6周野生型和敲除雌鼠分别与野生型雄鼠交配得到的早期胚胎进行培养，发现大部分的胚胎阻滞在1-cell时期，只有极少数能发育到囊胚，RT-PCR检测发现原本在ZGA过程中表达激增的相关基因表达量明显减少，2-cell时期敲除组整体转录活性明显降低。以上结果表明，RTCB可能通过调节了一些卵母细胞发育成熟过程中的特殊因子的剪切后连接，进而影响着卵母细胞的发育、卵子的质量和早期胚胎发育。本项目研究内容已按计划全部完成，另外还分别收取3组4周、6周野生型和敲除组GV期卵母细胞，进行了RNA-seq和生物信息学分析，但由于RTCB并非广谱的RNA连接酶，只特异性调节少数RNA的剪切后连接，所以接下来需要通过进一步的筛查，从敲除后表达量显著变化的转录本中寻找出RTCB的潜在靶标mRNA，进而深入研究其发挥作用的分子机制。本项目的完成对于更加全面细致地揭示RTCB的生理功能，深刻地理解卵母细胞发育过程中的调控机制，更好地提高辅助生殖技术有着重要的意义。