JNK、p38信号转导与线粒体、死亡受体途径在大骨节病发生发展中作用机制的研究

针对大骨节病软骨细胞凋亡与坏死发生及其环境致病因素不明的关键问题，以近年来利用差异表达基因芯片和蛋白组学技术所获大骨节病软骨细胞损伤的分子生物学特征为基础，采用人群调查与基础实验相结合的方法，应用体外细胞培养、western blot、RT-PCR等技术，从人体、细胞、基因、蛋白水平不同层次，首先确定与大骨节病软骨细胞凋亡关系密切的JNK及p38信号转导、线粒体及死亡受体途径；籍此为基准，通过低硒、T-2毒素的析因实验设计方法诱导正常人软骨细胞发生大骨节病软骨细胞凋亡信号转导与凋亡途径的作用，力求从不同角度探索引起大骨节病软骨细胞损伤的分子机制及其与环境有害因素的关系，为有效推进环境因素－软骨细胞凋亡及其途径与信号转导－软骨细胞坏死之间的关系及其阻断措施的研究，判定低硒、T-2毒素何为主辅或联合损害大骨节病软骨细胞的始动病因，提高大骨节病早期诊断、早期预防的水平，提供新的科学依据。

针对大骨节病（Kashin-Beck Disease，KBD）病因发病机制的重要科学问题，本课题进行了JNK及p38信号转导通路、线粒体及死亡受体途径与KBD软骨细胞凋亡的关系、硒对T-2毒素诱导软骨细胞JNK、p38信号转导、线粒体及死亡受体途径作用机制的的研究。依据“大骨节病诊断标准”，调查了陕西省KBD1956例，在知情同意下，收集血液1026份和软骨样品60例。采用软骨细胞培养、qRT-PCR、双向凝胶电泳分离、质谱、线粒体和糖基转移酶相关基因芯片等技术，获得的主要创新性结果有：①KBD软骨组织JNK通路相关的p-JNK及下游的ATF2和p-ATF2蛋白、p38通路相关的p38和p-p38蛋白表达均较软骨细胞显著增高，明确了KBD软骨中JNK通路相关蛋白因子磷酸化水平升高。T-2毒素通过JNK、p38信号转导通路促进诱导软骨细胞过度凋亡，纳米硒能显著抑制T-2毒素诱导的软骨细胞凋亡。②鉴定出KBD软骨细胞不同于正常人的27个差异表达蛋白质点，其中上调蛋白10个，下调蛋白17个，主要涉及糖代谢和细胞骨架重组；③IPA分析发现KBD软骨9个显著性上调差异表达的线粒体相关基因；通路分析发现KBD软骨氧化磷酸化、丙酮酸盐代谢和凋亡信号通路上调；④ KBD软骨细胞线粒体功能障碍，表现有软骨细胞线粒体呼吸链复合体Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性降低，柠檬酸合酶活性升高，线粒体膜电位下降，细胞内ATP含量减少，细胞内活性氧含量增加，细胞色素C从线粒体释放增多，Caspase-9和-3激活，细胞凋亡显著增多;⑤KBD和骨关节病软骨细胞胞浆和胞膜的Fas相关死亡域蛋白表达显著高于对照组，而细胞型Fas相关死亡域样白介素-1β转换酶抑制蛋白、人硫酸软骨素N-乙酰氨半乳糖胺基转移酶-1和透明质酸和蛋白多糖连接蛋白-1 mRNA表达显著降低。 本项目资助10名博士生、2名硕士生，其中4名授予博士学位。发表学术论文21篇，其中SCI收录论文12篇，主编论著1部，联合培养博士研究生1名。