TGFβ1/Smad信号在鳖甲煎改良方抑制肝纤维化中的作用和机制研究

It's well-known that the key factors of hepatic fibrosis occurrence are activation of hepatic stellate cells(HSC) and then abnormally expression of extracellular matrix(ECM). Transforming growth factor beta (TGFβ1) can activate HSC and promote ECM expression. TGFβ1 has an very important signal transduction effect in adjusting HSC's ECM expression. In our primary study it was found that the Modified recipe of Turtle Shell Decoction can be used to improve hepatic function and inhibit the rat's Hepatic fibrosis in vitro. Although the Modified recipe of Turtle Shell Decoction has effect of inhibition the rat's Hepatic fibrosis by inhibiting HSC TGFβ1/Smad signal way, its mechanism has been unclear. In this project the procession of hepatic fibrosis will be firstly monitored by AMF and confocus microscope, then the Effect and mechanism of HSC TGFβ1/Smad inhibition would be investigated with immunity histochemistry, hybridization in situ, RT-PCR, RPA, Western blotting and cell culture; the inhibition of HSC TGFβ1/Smad would be studied though observing the Modified recipe of Turtle Shell Decoction inhibiting HSC TGFβ1/Smad after rat's hepatic tissue being impacted with CCl4; the expression of TGFβ1 and its recceiptor，phosphated Smads and Smurf would be explored. The therapy mechanism of the Modified recipe of Turtle Shell Decoction will be investigated in this project.

肝星状细胞（HSC）激活及其激活后细胞外基质(ECM)异常表达是发生肝纤维化的关键，TGFβ1是激活HSC并促进其表达ECM的关键因子，TGFβ1信号转导在HSC ECM表达调节中起重要作用。我们的前期研究结果显示，鳖甲煎改良方可改善肝纤维化患者肝脏功能、显著抑制大鼠实验性肝纤维化。鳖甲煎改良方可能通过抑制HSC TGFβ1/Smad信号通路而起到抗肝纤维化作用，但作用机制尚未明确。本项目拟采用原子力显微镜和共聚焦显微镜监控肝纤维化进程；运用免疫组化、原位分子杂交、RT-PCR、核酸酶保护实验、Western 印迹和细胞培养等技术方法，观察鳖甲煎改良方对CCL4损伤致肝纤维化大鼠肝组织、HSC TGFβ1/Smad信号转导途径的抑制作用，研究TGFβ1及其受体，磷酸化Smads和Smurf表达情况，探讨鳖甲煎改良方防治肝纤维化的分子机制，为该方在肝纤维化患者的临床应用提供实验依据。

肝星状细胞（HSC）激活及其激活后细胞外基质(ECM)异常表达是发生肝纤维化的关键，TGFβ1 是激活HSC并促进其表达ECM的关键因子，TGFβ1信号转导在HSC ECM 表达调节中起重要作用。我们的前期研究结果显示，鳖甲煎改良方可改善肝纤维化患者肝脏功能、显著抑制大鼠实验性肝纤维化。鳖甲煎改良方可能通过抑制 HSC TGFβ1/Smad 信号通路而起到抗肝纤维化作用，但作用机制尚未明确。我们已执行的研究计划要点：（1）购买到大鼠肝星状细胞株HSC-T6并进行很好的传代、冻存与扩增；（2）成功复制大鼠肝纤维化模型，并进行了其纤维化组织的石蜡包埋、切片、HE染色TGFβRI免疫组化染色及其光镜、电镜观测；（3）成功设计与筛选到TGFβ1的最佳RNA干扰靶点，其序列为GTCAACTGTGGAGCAACAC；（4）成功构建大鼠TGFβ1基因RNA干扰慢病毒载体pGreenPuro/TGFβ1shRNA，并予以测序鉴定；（5）沉默HSC-T6细胞的TGFβ1基因，能阻抑该细胞的生长、增殖及其核抗原PCNA基因、PCNA蛋白的表达，并抑制其Ⅰ型胶原（Col1a1）、TGFβRI、RⅡ的表达与分泌；（6）完成了鳖甲煎改良方（MTSD）的自制工作；进行了MTSD影响肝星状细胞HSC-T6生长、增殖的CCK-8法检测；MTSD影响HSC-T6细胞的TGFβRⅠ、TGFβRⅡ表达的免疫荧光组化染色检测；MTSD影响HSC-T6细胞的TGFβ1、Smad3与Smad7基因表达变化的Real-time PCR检测；MTSD影响HSC-T6细胞的TGFβ1、Smad3与Smad7蛋白表达变化的Western blot检测；MTSD影响HSC-T6细胞的细胞周期与细胞凋亡的流式细胞仪检测。（7）完成了鳖甲煎改良方含药血清的制备，并探讨了该含药血清对HSC-T6的生长、增殖，对HSC-T6细胞的PCNA基因、PCNA基因编码蛋白，对HSC-T6的细胞周期、细胞凋亡等的影响。观察了鳖甲煎改良方对CCL4损伤致肝纤维化大鼠肝组织、HSC TGFβ1/Smad 信号转导途径的抑制作用，探讨了鳖甲煎改良方防治肝纤维化的分子机制。以上研究内容已发表国内CSCD论著3篇、SCI论著1篇，另一篇SCI论著已被接收。本研究结果为鳖甲煎改良方在肝纤维化患者的临床应用提供了一定的实验依据。