曼氏裂头蚴具有早期诊断价值的抗原筛选与鉴定

曼氏裂头蚴病是由曼氏迭宫绦虫幼虫侵入人体引起的一种严重的自然疫源性疾病，河南省为新发现的自然疫源地，主要因生食蝌蚪而感染，具有明显的地域特征。本病的病原学诊断非常困难，主要依靠手术发现虫体而确诊。目前国内外用于本病血清学诊断的抗原主要为裂头蚴可溶性抗原或排泄分泌抗原，但与其他寄生虫病人血清有交叉反应而出现假阳性，且在感染后4周才能检出裂头蚴抗体，而重症病人可在感染后3-4周死亡。该项目拟应用蛋白质组学与免疫组学筛选不同发育阶段裂头蚴的特异性排泄分泌蛋白作质谱分析，将早期高效表达的特异性抗原基因进行分子克隆、体外表达及纯化，观察其免疫应答特性（种或期特异性，抗体类型等）。建立重组抗原ELISA，检测不同剂量裂头蚴感染小鼠后不同时间血清特异性抗体，预期1条裂头蚴感染后2 周即可检出特异性抗体。该项目为提高裂头蚴病早期诊断的敏感性与特异性、出现本病暴发的突发公共事件时进行快速筛查奠定基础。

曼氏裂头蚴病是由曼氏（欧猬）迭宫绦虫幼虫引起的一种严重的自然疫源性疾病。目前国内外用于本病血清学诊断的抗原主要为裂头蚴可溶性抗原或排泄分泌抗原，但与其他寄生虫病人血清有交叉反应而出现假阳性。该项目应用蛋白质组学与免疫组学对曼氏迭宫绦虫裂头蚴的排泄分泌蛋白（ES）进行了双向电泳（2-DE）与MALDI-TOF/TOF-MS分析，筛选到了能被早期感染血清识别的编码36kDa蛋白的曼氏迭宫绦虫半胱氨酸蛋白酶（SeCP），将SeCP基因进行了分子克隆、体外表达及纯化，制备重组SeCP蛋白（rSeCP）与抗rSeCP抗体。然后对SeCP的特性进行了鉴定。Western blotting结果显示，在裂头蚴粗抗原、ES抗原中存在有天然的SeCP。RT-PCR与免疫荧光试验（IFT）发现，SeCP在不同宿主（蛙与小鼠）体内的裂头蚴期均有转录与表达，但在成虫与虫卵期无转录与表达，SeCP主要定位在裂头蚴的皮层与实质组织中，表明SeCP是裂头蚴的期特异性蛋白。rSeCP具有天然半胱氨酸蛋白酶的酶活性和水解宿主不同蛋白的功能，提示SeCP与裂头蚴的侵入、移行和致病有关。rSeCP 免疫小鼠诱导了Th2型为主的免疫应答, 抗rSeCP抗体对裂头蚴具有ADCC作用。建立的rSeCP-ELISA检测裂头蚴感染小鼠的敏感性和特异性分别为96.67%和100%；小鼠感染裂头蚴后10d~12d可检出特异性的抗裂头蚴抗体。rSeCP-ELISA用于诊断裂头蚴病人时的敏感性和特异性分别为100%和98.22%，特异性明显高于ES抗原ELISA的87.57%。该项目还对裂头蚴28.7 kDa抗原多肽（SmAP）与酪蛋白激酶I（SeCKI）基因进行了克隆、表达与鉴定；对河南、湖南等地区的裂头蚴地理株通过形态学和分子生物学进行了虫种鉴定和遗传进化分析，发现我国不同地区的裂头蚴地理株均为曼氏迭宫绦虫裂头蚴。该项目建立的rSeCP-ELISA方法明显提高了裂头蚴病早期血清学诊断的敏感性与特异性，为出现裂头蚴病暴发的突发公共事件时进行快速筛查与早期诊断奠定了基础。