旋毛虫未成熟与成熟幼虫共表达抗原的筛选及用于肉类检验的基础研究

旋毛虫是一种危害严重的食源性寄生虫，也是肉类及肉制品中首检和强制性检疫的人兽共患寄生虫。目前国内外用于旋毛虫检验的消化法在轻度感染时容易漏检，且感染后17d的未成熟幼虫已有感染性，未成熟幼虫可被消化，此时检测肉汁旋毛虫抗体亦为阴性，消化法与检测抗体不能用于旋毛虫早期感染肉类的检疫。该项目拟应用蛋白质组学与免疫组学筛选3种旋毛虫（旋毛虫、乡土旋毛虫、伪旋毛虫）未成熟与成熟幼虫共表达的属特异性排泄分泌蛋白作质谱分析，筛选未成熟与成熟幼虫2个时期均高效表达的属特异性抗原进行分子克隆、体外表达及纯化，制备重组抗原与抗重组抗原抗体IgY及单抗，建立夹心ELISA，检测3种旋毛虫轻度与早期感染小鼠肉汁中的循环抗原，并与消化法及间接ELISA进行比较。该项目为提高旋毛虫轻度与早期感染肉类检疫的敏感性与特异性、保证肉类食品安全、出现旋毛虫病暴发的突发公共事件时进行病原体溯源与快速筛查奠定基础。

该项目应用蛋白质组学与免疫组学对旋毛虫幼虫的排泄分泌（ES）蛋白进行了双向电泳（2-DE）与MALDI-TOF/TOF-MS分析，将未成熟与成熟幼虫2个时期均高效表达的旋毛虫35.5kD蛋白抗原进行了分子克隆、体外表达及纯化，制备35.5kD重组蛋白与抗重组蛋白抗体。然后对旋毛虫35.5kD重组蛋白进行了鉴定；发现该蛋白基因在旋毛虫成虫、新生幼虫、成囊前期幼虫和成囊期幼虫4个时期均有转录与表达，在旋毛虫（T1）、乡土旋毛虫（T2）、伪旋毛虫（T4）及纳氏旋毛虫（T7）亦均有转录与表达，该重组抗原与其他寄生虫病（日本血吸虫病、并殖吸虫病、华支睾吸虫病）患者血清以及正常人血清与正常小鼠无交叉反应，表明该抗原为旋毛虫属特异性抗原。制备了抗旋毛虫抗原的IgY与单抗，其中8株单抗可特异性地识别旋毛虫感染后11d~13d的早期幼虫抗原；以抗旋毛虫抗原的IgY为捕获抗体，以单抗IgG或IgM为检测抗体，建立了检测旋毛虫循环抗原的双抗体夹心ELISA（IgY-IgG单抗夹心ELISA与IgY-IgM单抗夹心ELISA），两种方法检测CAg的敏感性均为1ng /mL，CAg的检出率分别在旋毛虫感染后24d 与10d达100%，明显早于抗旋毛虫抗体IgG与IgM，表明IgY-单抗夹心ELISA可用于旋毛虫轻度感染的早期特异性诊断与检验。通过对旋毛虫病人肌肉活检标本及猪肉中幼虫的形态学、生物学特性及分子生物学研究，首次证实Trichinella spiralis为我国人体旋毛虫病的致病虫种。该项目还对肉类中旋毛虫检验的人工消化法进行了改进，改进后的消化法（肉样43℃消化2 h、消化液冷却至4℃时应用40目筛过滤及锥形量杯沉淀）的最低检出水平由每克肌肉3～5条幼虫提高到0.1～1条幼虫；对肉类中旋毛虫成囊前幼虫检验时，贝氏法明显优于消化法。