电针通过介导组蛋白H4K16乙酰化表观遗传修饰调控细胞自噬减轻脑缺血再灌注损伤的机制研究

This project is based on our long term clinical and experimental research work about cerebral ischemia treated by electroacupuncture,combined with research progress on the relationships among histone epigenetic modification、autophagy and cerebral ischemia-reperfusion injury at present.The project is to be studied both in vivo and in vitro the functional mechanism of histone 4 lysine 16 acetylation(H4K16ac) in regulating autophagy treated by electroacupuncture therapy. Through the establishment of rat MCAO model and neuron oxygen-glucose deprivation-reoxygenation model,making use of transmission electron microscope、immunohistochemistry、western blot、real time PCR、siRNA、RNA-seq and ChIP-assay technology,we are to analyze the relationships of electroacupuncture、hMOF、Sirt1、H4K16ac、LC3-Ⅱand Beclin1,through H4K16ac epigenetic modification regulating autophagy target gene transcription activity to clarify regulation mechanism of cerebral ischemia-reperfusion injury treated by electroacupuncture. Revealing and further regulating autophagy in the course of cerebral ischemia will be therapy target for ischemic brain injury.This project will provide scientific evidences for cerebral ischemia-reperfusion injury treated by electroacupuncture,thereby instruct acupuncture clinical practice.

本项目基于我们长期针灸治疗脑缺血的临床和实验研究工作基础，结合目前组蛋白表观遗传修饰与细胞自噬及脑缺血再灌注损伤之间相互关系的研究进展，本项目拟从在体和离体实验探讨组蛋白4第16位赖氨酸乙酰化（H4K16ac）表观遗传修饰在电针调控细胞自噬减轻脑缺血再灌注损伤中的作用机制，通过建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型及神经元糖-氧剥夺再灌注损伤模型，借助透射电镜、免疫组织化学、western blot、Real Time PCR、siRNA、RNA-seq、ChIP-assay等技术分析电针、hMOF、Sirt1、H4K16ac、LC3-Ⅱ、Beclin1之间的关系，从H4K16ac调节自噬靶基因转录活性角度阐明电针抗脑缺血再灌注损伤的机制，揭示并进一步调控脑缺血过程中的自噬将有望成为缺血性脑损伤的治疗靶点，为进一步研究电针抗脑缺血再灌注损伤的机制提供新的思路和科学实验依据，从而指导针灸临床实践。

缺血性脑卒中严重危害着人类的健康，脑缺血再灌注损伤是发病关键环节。电针能够有效地减轻脑缺血再灌注损伤。细胞自噬作为一种新的缺血性脑损伤的干预靶点，组蛋白H4K16ac表观遗传修饰能够调控自噬的发生。本项目从在体和离体实验探讨组蛋白4第16位赖氨酸乙酰化（H4K16ac）表观遗传修饰在电针调控细胞自噬减轻脑缺血再灌注损伤中的作用机制，通过建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型及神经元糖-氧剥夺再灌注损伤模型，借助透射电镜、免疫组织化学、western blot、Real Time PCR、siRNA、ChIP-assay等技术分析电针、hMOF、Sirt1、H4K16ac、LC3-Ⅱ、Beclin1之间的关系。研究发现，电针组和hMOFsiRNA组能够增加脑血流，降低神经功能缺损评分，TTC染色及CV染色结果显示脑梗死体积减小，脑水肿产生减少。电针组和hMOFsiRNA组能够抑制hMOF蛋白的表达，增加Sirt1蛋白的表达，并且增加了Beclin1 、LC3-Ⅱ和H4K16ac蛋白的表达。电针组和hMOFsiRNA组能够抑制hMOF的mRNA的表达，增加Sirt1mRNA的表达，并且增加了Beclin1mRNA的表达。透射电镜超微结构显示，电针组和hMOFsiRNA组神经细胞水肿有不同程度的减轻，胞质内各种细胞器的水肿也有所减轻，部分胞质溶解；神经细胞的自噬作用增强，自噬溶酶体的数量增多，可见溶酶体包裹自噬泡形成自噬溶酶体。CCK-8法显示，电针血清组和hMOFsiRNA组细胞增殖活力增加，流式细胞术显示，电针血清组和hMOFsiRNA组能够抑制神经元细胞凋亡。ChIP检测H4K16ac在自噬靶基因Beclin1启动子区的结合程度，结果显示电针组和hMOFsiRNA组的H4K16ac在自噬靶基因Beclin1启动子区的结合程度较模型组和Sirt1抑制剂组明显增强。我们认为电针抗脑缺血再灌注损伤的作用可能是电针通过调节组蛋白H4K16ac的表达，从而调控自噬的发生，继而减轻了脑缺血再灌注损伤，发挥电针脑保护作用，从H4K16ac表观遗传修饰调节自噬靶基因转录活性角度阐明电针抗脑缺血再灌注损伤的调控机制，揭示并进一步调控脑缺血过程中的自噬将有望成为缺血性脑损伤的治疗靶点，为进一步研究电针抗脑缺血再灌注损伤的机制提供新的思路和科学实验依据。