针刺预处理诱导组蛋白乙酰化抗心肌缺血再灌注损伤的表观遗传调控机制研究

We got a new discovery from a project of the 973 program. We found that the expression levels of histone acetylation showed opposite change in rats’ heart tissue, when faced with physical or myocardial ischemia-reperfusion injury (MIRI) condition after 12days electro-acupuncture treatment. The increasing evidences showed that histone acetylation mediated epigenetic regulation is a key regulatory factor for the cardioprotection of MIRI. So, we hypothesize that epigenetic regulation of histone acetylation is a key mechanism for protecting against MIRI treated by acupuncture preconditioning. Meanwhile, we found that energy metabolism and cell survival signaling pathway are closely related with cardioprotection of acupuncture pretreatment via RNA-seq technique in the preliminary results. Based on these new findings, we will employ chromatin immunoprecipitation technique, Protein silencing technique, HPLC, immunohistochemistry, WB, qPCR technology, and so on, to reveal the key role of histone acetylation in myocardial protection treatment with acupuncture preconditioning at Neiguan acupoint from the positive and negative ways. And then, we will show a cascading effect mechanism according to the route “Acupuncture pretreatment — histone acetylation epigenetic regulation — myocardial energy metabolism optimization — reduce cell death — myocardial protection”, which will be a evidence for explain how to achieve protective effects treated by acupuncture preconditioning. Therefore, the research will play an important role in understanding the acupuncture science, which induces the activation or expression of endogenous protective substances. At the same time, it will provide a scientific basis for clinical application of acupuncture therapy, and also further enrich the scientific connotation of acupuncture.

本项目在973课题研究获得“针刺诱导心肌组蛋白乙酰化”新发现基础上，结合表观遗传调控是实现心肌缺血再灌注损伤（MIRI）保护关键环节的研究前沿，提出“组蛋白乙酰化表观遗传调控是针刺预处理抗MIRI的关键机制”假说。结合我们前期高通量测序结果：能量代谢、细胞存活构建的信号通路可能是针刺预处理诱导组蛋白乙酰化表观遗传调控的核心途径，本研究整合表观遗传学、分子生物学等研究方法，引入前沿的染色质免疫共沉淀技术及成熟的在体蛋白阻断和激动、高效液相、WB等技术，从正、反两个途径，研究针刺预处理是否能通过诱导组蛋白乙酰化，影响能量代谢、细胞存活构建的信号通路，实现对MIRI的表观遗传调控，以期揭示“针灸预处理—组蛋白乙酰化表观遗传调控—能量代谢优化—细胞死亡减少—心肌保护”级联效应机制，阐释针刺预处理诱导组蛋白乙酰化新发现的科学意义，将其诱导内源性保护的研究引向深入，并进一步丰富针灸“治未病”科学内涵。

缺血再灌注损伤是阻碍各种缺血性心肌病治疗措施的关键环节，目前仍无有效的治疗措施，探寻新的有效防治该损伤的技术和方法是目前研究的热点。针灸激活内源性物质产生治疗效应已形成共识，目前已初步证实针灸预处理能较好的实现抗心肌缺血再灌注损伤（MIRI），但机制尚未完全阐释，直接影响其向临床应用转化，急待深入研究。课题组前期结果显示，电针预处理能有效的实现MIRI保护，该效应的产生可能与其诱导组蛋白乙酰化水平、优化能量代谢和减少细胞死亡有关，但具体作用机制尚不明确。.本研究沿用“内关”穴进行电针干预，以MIRI和心肌缺血（MI）模型鼠为研究对象，从心肌形态、功能、生化、存活率角度，全面评价电针预处理和后处理促心肌保护效应，接着评价心肌细胞凋亡情况，随后从检测心肌线粒体功能和细胞死亡相关信号通路、心肌组织能量代谢、外周血代谢谱、心肌组织自噬和炎症物质变化，并同时观察心肌组织中组蛋白乙酰化相关物质表达水平，明确其在电针预处理促心肌保护中的作用。结果表明，电针预处理可通过诱导组蛋白乙酰化表达（以促进H3K9ac、H3K27ac表达，抑制去乙酰化酶HDAC4为代表），促进抗凋亡蛋白（Bcl2为代表）表达，抑制经典促凋亡蛋白（Caspase3为代表）和非经典促凋亡蛋白（Endo G、AIF）表达，同时还抑制MAPK信号通路，降低心肌细胞mPTP开放程度，促进心肌细胞存活，降低血清cTnT为代表的心肌酶谱水平，减少心肌梗死面积和心律失常发生，最终实现提高存活率目的。同时，电针干预可通过促进心肌组织中p-AMPKα和CD36、GLUT4等能量转运相关物质表达，有效调控以ATP、AMP、Pyruvate、GTP为代表的能量代谢物质，和逆转心肌损伤引起的以氨基酸代谢、能量代谢、MAS和谷氨酸代谢相关为代表的代谢变化，并有效调节ULK1和Beclin-1蛋白的表达水平，从而影响自噬，介导心脏保护。此外，电针预处理，还可能通过减少脾脏、心脏组织中巨噬细胞数量，促进其向M2型转化，降低心肌组织中NLRP3、IL-1β蛋白表达水平，抑制炎性小体活化，减轻心肌局部炎性反应，实现心肌保护效应。