融合自组装双亲短肽提高Pseudomonas aeruginosa脂肪氧合酶热稳定性机制的研究

Lipoxygenase is an important food enzyme. In our previous study, self-assembling amphipathic peptide (SAP) from zuotin protein sequence was fused to the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa lipoxygenase (LOX), yielding a fusion enzyme (SAP-LOX) with an enhanced thermal stability. This is the first report regarding the enhancement of thermal stability of enzymes by fusing SAP. Taking the SAP-LOX as the object of study, we intend to carry out systematic researches on following three aspects: (1) Based on the crystal structure analysis and molecular dynamic simulation, we will the quantitative relationship between the thermal stability and intramolecular interaction added by SAP fusion; (2) By studying the formation of SAP-LOX oligomers and its influence factors, will examine the quantitative relationship between the thermal stability and interaction among SAP-LOX induced by SAP; (3) By strengthening the intermolecular and intramolecular interactions of SAP-LOX, we will design SAPs with high stabilization efficiency and the do the universality analysis. Conclusions making here will further enrich stabilization mechanism of enzyme fused with short peptide, and it will also provide new examples and ideas for molecular modification.

脂肪氧合酶是一种重要的食品酶。申请人前期研究发现，源于酿酒酵母Zuotin蛋白的自组装双亲短肽(SAP)与Pseudomonas aeruginosa脂肪氧合酶（LOX）的N-端融合，得到了热稳定性显著提升的融合酶（SAP-LOX）,这是国内外首次报道融合SAP提高酶热稳定性的研究。申请人拟以该SAP-LOX为研究对象，从三方面对其热稳定化机制进行系统研究：(1) 通过SAP-LOX晶体结构解析和分子动力学模拟，确定SAP引入的分子内相互作用与酶稳定化的定量关系；(2) 通过研究SAP-LOX寡聚体的形成及影响因素，探明SAP介导的分子间相互作用与酶稳定化的定量关系；(3) 基于强化SAP-LOX分子间和分子内相互作用，设计高热稳定化效能的SAP，并验证其通用性。研究得到的相关结论将深入揭示短肽融合促进酶稳定化的机制，同时为分子改造提供新的范例和思路。

自组装双亲短肽(Self-assembling amphipathic peptides, SAPs)是一类亲水、疏水氨基酸交替分布，能够自发组装成为特定纳米结构的特殊短肽。融合在酶或蛋白N端时，可起到促进蛋白质表达及稳定性的功能。本项目对SAPs的稳定化机制及开发应用进行了研究。主要结果如下：(1) 根据相关理化性质及酶蛋白结构分析初步判定，N端融合双亲短肽后所引入“分子间”疏水作用力及“分子内”的氢键是提高碱性果胶酶热稳定性提高的主要原因；(2) 分别对影响SAPs稳定化及促表达的功能的影响因素进行分析，确定SAPs的长度、连接肽的长度及刚柔性对稳定化起到主要作用。SAPs的氨基酸组成，长度，连接肽的刚柔性对融合蛋白的表达量起到主要作用； (3) 根据影响SAPs稳定化及表达量的关键因素，开发出促进酶稳定化的SAP文库和促进酶表达量SAP文库。通过应用文库，使果胶酶(PGL)、脂肪氧合酶（LOX）及天冬酰胺酶(ASN)热稳定性及表达量显著提高；(4)开发出S1v1(AEAEAHAHAEAEAHAH)多功能短肽，使PGL、LOX及GFP等酶或功能蛋白的表达、亲和纯化效率、催化活性及热稳定性的均有明提高。研究得到的相关结论初步揭示了短肽融合促进酶稳定化的机制，研究构建得到的促蛋白稳定性及表达的SAP和连接肽库，以及多功能肽可应用于各种酶和功能蛋白的性能改造与生产。