极端环境土壤中链霉菌抗MRSA活性物的快速发现及精准分离研究

Methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA) is one of the main pathogenic bacteria in hospital and community infection. Its expressed a variety of antibiotic resistance genes and showed different degrees of resistance for the beta amides, quinolones, amino glycoside, tetracycline, macrocyclic lactone antibiotics. MRSA and AIDS, viral hepatitis, the three most difficult to solve infectious diseases for the world. Therefore, it is urgent to develop a new type of antibiotics for MRSA and Streptomyces is one of the most antibiotics producing microorganisms. As the research object of this project by Streptomyces strains fermented liquid, which was isolated from the soil of the Tibetan Plateau. Using molecular sieve chromatography remove small molecular weight compounds from the fermented liquid and using LC-MS and GC-MS quickly found macromolecular compounds. UV absorption and analysis conditions of macromolecular compounds are also determined at the same time. Based on the UV absorption and analysis condition, we use the preparation of high performance liquid chromatography (HPLC) fast accurate preparation of macromolecular compounds in strains fermented liquid. Using ELISA detection method, we quickly screen out the monomer compounds with MRSA activity and we use modern spectral methods such as NMR, X-ray single crystal diffraction to determine the structure of the active monomers compounds.

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为医院和社区感染的主要病原菌之一，MRSA菌表达了多种抗生素耐药相关基因，对β内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类抗生素均表现不同程度的耐药性，与艾滋病、病毒性肝炎并列为世界三大最难解决的感染性疾病。因此，研发一种对MRSA有效的新型抗生素迫在眉睫，而链霉菌是一类产抗生素最多的微生物。本项目以从青藏高原土壤中分离得到的链霉菌菌株发酵液为研究对象，运用分子筛层析将小分子量化合物从发酵液中去除；利用液质联用色谱和气质联用色谱快速发现其中大分子化合物，同时确定其紫外吸收和分析条件；并以上述紫外吸收和分析条件为依据，利用制备高效液相色谱快速精准的制备菌株发酵液中大分子化合物，同时采用ELISA检测方法，快速筛选出具有杀灭MRSA活性的单体化合物；运用NMR、X-单晶衍射等现代波谱手段确定活性单体化合物的结构。

本项目以青藏高原土壤链霉菌菌株发酵液这一复杂的天然产物体系为研究对象，探索其中具有抑菌活性的新结构化合物；其主要研究内容包括：①分析链霉菌基因序列，并结合多级质谱，初步判断菌株发酵液中可能存在的各种物质，为活性单体化合物的快速发现及精准分离作指导。②利用Pre-HPLC 等分析分离仪器，精准分离菌株发酵液中抗 MRSA 的活性单体化合物，并确定所得活性单体化合物的结构。.基于上述研究内容，本项目获得的主要成果为：发现了具有广谱抗性的链霉菌新种；利用UPLC-MS、Pre-HPLC等分析分离仪器，建立了一种简单有效，并能快速发现及精准分离青藏高原土壤中链霉菌菌株发酵液中具有抑菌活性的单体化合物的的分析分离方法；分离得到了88种单体化合物，其中新结构化合物3种；利用EIMS、HRESIMS、IR、UV、1D NMR (1H NMR、13C NMR、DEPT)、2D NMR (1H-1H COSY 、HMBC)等现代波谱技术，并结合文献数据报道，鉴定了这些化合物的结构，包括喹喔啉类化合物、酰胺类化合物、苯的衍生物、肽类化合物、萜类化合物；并以前期实验室分离得到化合物为活性先导，在保留其活性母核—喹喔啉官能团的基础上，设计以下四个系列的喹喔啉衍生物（喹喔啉-脲类衍生物、喹喔啉-氨基甲酸酯类衍生物、喹喔啉-酰脲类衍生物、喹喔啉-酰硫脲类衍生物），通过引入抗生素中常见的四种活性官能团，即脲基、酰脲基、磺酰脲基及磺酰脒基，设计合成了44个新型喹喔啉衍生物，并测试其抗MRSA活性；从132种单体化合物中共筛选出了9种具有较好抑菌活性的单体化合物，为新型天然杀灭MRSA 抗生素的研究与开发奠定了物质基础。