用于水圈微生物代谢分析的单细胞基因表达技术的研发及其应用

For functional analysis of microbes in the hydrosphere, two major challenges need to be overcome: 1) 99% of microbes in nature are unculturable; 2) understanding derived from laboratory-based pure–culture studies may not represent microbes in nature well enough. To address the issues, we propose to develop single-cell gene expression analysis technologies to study cyanobacteria in the hydrosphere. The specific aims are: 1) developing single-cell RT-PCR and single-cell transcriptomics to analyze gene expression in microbial single cells directly without cultivation; 2) as a proof of concept, the technologies developed under this proposal will be applied to the analysis of ocean cyanobacteria; 3) constructing the gene expression network of cyanobacteria under low-light environments in deep sea for deciphering new metabolic and regulatory mechanisms. Once executed, the study will establish the most needed technologies for the research community of microbes in hydrosphere. Meanwhile, the study on cyanobacteria will provide important insights on marine microbial ecology, ocean carbon sink and global carbon cycling.

水圈微生物的生理生态功能研究面临诸多的挑战，其中的两个是：一）超过99％的环境微生物无法在实验室中获得培养；二）对于能够实现培养的微生物，由于实验室培养条件很难完全重现其天然生存环境，因而造成从纯培养获得的知识不能充分体现自然界生存的微生物的生理功能。针对这些挑战，本申请将发展和应用微生物单细胞基因表达分析技术对海洋环境中的光合蓝细菌的生理生态学进行研究，解析在典型大洋生态环境中起关键功能的海洋蓝细菌的代谢新途径及新调控机制。具体目标：一）优化微生物单细胞RT-qPCR和全转录组分析技术；二）作为技术的可行性证明，将应用这些技术对海洋光合蓝细菌进行研究, 实现未经培养微生物的单细胞全转录组分析；三）构建海洋低光环境中光合蓝细菌的基因网络，发现蓝细菌在典型大海洋生态环境中的代谢新途径及新调控机制。相关技术的开发将为水圈环境中其他重要微生物在地球元素循环中的意义研究提供重要的技术手段。

对水圈微生物的研究面临诸多的挑战，如超过99％的微生物无法在实验室中获得培养、实验室培养条件很难重现微生物天然生存环境，以及传统的微生物学方法难以对于处于共培养中的微生物进行分析等。针对这些挑战，本研究通过发展和应用微生物单细胞基因表达分析技术及显微成像技术对水环境中的光合蓝细菌及其他细菌的生理生态学进行研究，解析水圈环境中微生物的代谢新途径及新调控机制。本研究中，一）我们首先通过优化单细胞基因表达分析技术，实现了对于多种微生物的单细胞基因表达分析。二）针对近海水域蓝细菌如聚球藻存在很多不同的亚种和变种，其中绝大多数没有基因组序列的问题，我们选择了聚球藻中保守度相对较高的psaA，atpA，psbE以及rpsL等基因，分别设计、筛选、并在单细胞水平上验证它们对于聚球藻单细胞基因表达强度测定的可行性，初步建立了对上述不同种属聚球藻进行单细胞基因表达分析的技术。三）我们使用单细胞基因表达技术分析了水环境中典型微生物互惠共生系统D. vulgaris和M. barkeri的建立和维持的分子机制。通过对共生驯化系统的单细胞基因表达分析，发现被检测的基因的基因表达异质性从原始纯培养菌株到共生0次传代时陡然增高，然而随着传代进行又会降低到稳定水平；同时，研究发现这些基因在单细胞水平的表达水平在共生期间明显高于纯培养，而且3个基因（如：DVU0847、DVU2802和DVU0310）表达量随共生传代明显递增，表明这些基因可能与共生关系的维持密切相关。四）我们建立了基于蓝细菌Synechococcus elongatus UTEX 2973和E. coli的人工共生混菌系统，并利用单细胞技术对人工混菌系统中菌体间的相互作用进行分析。研究将为研究水圈中混合微生物群体的代谢及调控机理提供重要的分子基础。五）我们开发了基于遗传改造、荧光标记菌毛及单细胞显微观察的方法，在单细胞水平上观察了蓝细菌Synechococcus elongatus 以及假单胞杆菌Pseudomonas aeruginosa 菌毛形态、分布与运动、DNA吞噬间的关系，以及节律周期等因素的变化对于蓝细菌菌毛及菌毛行为的影响。六）利用高通量测序的方法，在全基因组水平解析了水圈重要微生物光合蓝细菌三种修饰位点的甲基化组，分析了DNA甲基化与DNA重组、基因表达、光合作用等重要生理过程之间的关联。