基于膜乳化技术的均一、智能IPN微球的构建和应用

本研究将膜乳化技术引入互穿网络聚合物(IPN)制备技术，制备具有良好刺激响应性、粒径均一、可控的微球，构建新型智能载酶微反应器，为蛋白质组学固定化酶解技术提供新方法新思路。研究线性高分子浓度及其单体的配比、交联剂用量等参数对IPN性能的影响，采用激光共聚焦、原子力显微镜等先进技术手段从微观层面考察不同组成IPN凝胶微球的溶胀行为特征，建立适合semi-IPN凝胶微球的溶胀行为模型，指导载体设计；考察酶浓度、活化剂用量、反应时间等因素对固载量及酶活的影响；以模型蛋白酶解为例，考察固定化酶活力、最适pH、最适温度、储存稳定性、重复利用性等；优化微反应器的LCST，使其低于最适酶解温度，从而保证酶解时处于疏水状态，发挥其智能性。根据这些参数优化微球结构及酶固定化反应，试用于蛋白质组复杂样品酶解处理，可期实现复杂蛋白质混合物的高效快速酶解。

蛋白质组学已成为当前研究热点，蛋白质组样品制备存在着耗时长、不能重复利用等问题，申请人制备半互穿网络结构的温敏微球固定化酶，处理蛋白质组混合物，可重复利用、降低处理时间。本研究主要研究结果如下：1）考察了单体配比，交联剂、引发剂的含量对微球内部互穿结构对微球制备的影响，优化制得了一系列不同结构的PNIPAM/PAA半互穿结构微球；2）完成了PNIPAM/PAA半互穿结构微球的形貌和刺激响应行为的表征，结果表明，所制备的微球其表面羧基分布均匀，并且具有很好的温度和 pH 双重敏感性；3）完成了PNIPAM/PAA微球酶固定化条件的优化，优化了：吸附时间、离子强度、反应过程pH、给酶量、EDC与微球羧基比例对酶固载量和酶活的影响，最优条件下制得的固定化酶的固载量和酶活分别达到 465 mg/g 和 86 %；4）优选出三种不同结构的PNIPAM/PAA 半互穿微球，分别在优化条件下进行酶固定化，考察了不同微球固定化酶的结合率与固载量。结果表明不同结构微球固定化酶的结合率均高于95%以上，固载量大致相同，为后续酶性质的对比提供了基础；5）考察了不同结构微球上固定化酶的分布情况，结果表明羧基的分布情况决定了酶被固定的位置；6）完成了不同微球固定化酶，并比较了固定前后微球形貌和性质，结果表明除了PNIPAM/PAA半互穿结构微球LCST值变化不大之外，其余三个结构微球固定化酶之后LCST值都发生了较大的变化；7）储存稳定性研究结果表明，储存到第28天，固定化酶的相对活力为均为80%以上，自由酶的相对活力为70%；8）最适温度结果表明，固定化酶在较大的温度范围内 (30 oC~40 oC) 能保持很高的活力，最适温度有所提高并且范围增大；9）最适pH研究结果表明微球通过羧基将酶固定后，使酶构象得到保持在pH 6~9区间能保持较高活力，在pH 8 处达到最高值，与自由酶相比最适pH在一定程度上得到了拓宽；10）完成了固定化酶酶解 BSA和蛋白质组混合物 效果考察，可将酶解时间由原来的 >12hr 缩短为<0.5h，大大提高了酶解效率，并且可以重复利用，这对进一步的应用将具有重要意义。