Smad4在血小板激活中的调控作用

TGF-β1 can influence vascular function and hemostasis through the Smad signaling pathway. Smad4 is the common mediator Smad (Co-Smad) which forms a complex with the receptor activated Smads (R-Smad). Smad4, as a key transcription factor in TGF-β signaling pathway, is involved in a variety of cell physical and pathological processes. But the effects of Smad4 on platelet activation are still unknown. We characterized platelet-specific Smad4 deficiency mice to elucidate the platelet-related functions of Smad4. We found that Smad4 deficiency caused mild thrombocytopenia. Functional analysis revealed that Smad4 deficiency inhibited agonist-induced platelets aggregation and significantly extended first occlusion time and tail bleeding time. Further studies showed that severe damage occurred to integrin αIIbβ3-mediated bidirectional (inside-out and outside-in) signaling in Smad4 deficiency platelets. Microarray data demonstrated that Smad4 deficiency altered the levels of multiple gene transcripts in platelets. Among these genes, Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1 (ROCK1)、ROCK2、 spleen tyrosine kinase (Syk) and Integrinβ1, which have been proved playing important roles in regulating platelet functions, were down-regulated several times. In this study, the role of Smad4 in platelet formation and platelet activation will be explored, shedding light on the important role of Smad4 on platelet development.

TGF-β的配体通过Smad信号途径传递细胞内的信号，Smad4是其中重要的转录因子，与其他Smad (R-Smad)蛋白形成复合物调控基因的表达。因此，Smad4在多种细胞的生理和病理过程中发挥作用。然而Smad4对血小板功能的调控作用还不清楚。课题组利用血小板特异敲除Smad4小鼠模型来研究Smad4对血小板功能的影响。发现Smad4缺失引起小鼠血小板轻度减少。同时抑制了血小板聚集、血栓形成、止血等功能。进而发现血小板整合素αIIbβ3介导的内向外及外向内信号受到影响。基因表达谱数据分析显示，Smad4缺失改变了血小板中多种基因的转录水平。其中ROCK2和Syk基因表达水平改变较大且与血小板功能密切相关。本研究拟利用该小鼠模型，进一步阐明Smad4对血小板功能的影响，并揭示Smad4在调控血小板形成及血小板激活中的作用机制，为理解血小板在血栓与止血中的功能提供一个新的视角。

Smad4在多种细胞的生理和病理过程中发挥作用。然而Smad4对血小板功能的调控作用还不清楚。课题组利用血小板特异敲除Smad4小鼠模型来研究Smad4对血小板功能的影响，并揭示Smad4在调控血小板形成及血小板激活中的作用机制。.Smad4缺失导致血小板数量轻度减少。课题组从生成减少还是破坏率增加两个方面进行分析。发现骨髓巨核细胞数量、形态及成熟度未发现明显改变。而Smad4敲除小鼠的网织血小板与总血小板数量比值减少，且约为17.7%。接近于Smad4敲除小鼠血小板减少的比例（约20%）。而血小板凋亡并未受到Smad4缺失的影响。这些结果提示，Smad4敲除小鼠血小板减少很可能是由于巨核细胞分化导致而并非是血小板清除增加引起的。.通过FeCl3颈动脉灼伤实验和鼠尾出血实验对血栓形成、止血等功能进行检测，发现 PF4-Smad4-/-小鼠第一血栓形成时间及鼠尾出血时间均延长，PF4-Smad4-/-小鼠血小板聚集功能减弱，与纤维蛋白原结合的血小板明显减少，Smad4缺失的血小板不能有效铺展。这些结果说明，Smad4缺失使血小板整合素αIIbβ3介导的内向外及外向内信号均受到影响，抑制了血小板聚集、血栓形成、止血等功能。.课题组利用流式的方法检测在不同刺激剂作用下，P-selectin的表达。结果显示，ADP和CRP刺激剂作用下，Smad4缺失的血小板P-selectin的表达明显减少，与Fg的结合减弱。同时Smad4缺失血小板铺展能力下降。而Smad4缺失并未影响ATP的释放。Smad4缺失血小板形成栓块能力明显弱于野生型血小板。. 课题组利用Microarray技术比较了PF4-Smad4-/-小鼠血小板与野生型血小板的基因表达差异，发现Smad4的缺失改变了大量基因的表达水平。其中Syk和ROCK2在PF4-Smad4-/-小鼠血小板中表达明显减少。利用Syk抑制剂（BAY61-3606）和ROCK的抑制剂（Y-27632）作用血小板，血小板表现出与Smad4缺失血小板相似的功能减弱。荧光素酶报告实验结果表明，Smad4可直接调控ROCK2基因的表达。但未发现对Syk基因的直接调控作用。