KSHV单链DNA结合蛋白ORF6的生物学功能研究

单链DNA结合蛋白(SSB)的功能在所有生物中十分保守，其在生物基因组DNA复制、基因转录、基因重组等过程中均起着十分重要的作用。卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）属疱疹病毒γ亚科，与人类卡波氏肉瘤的发生有关。目前对KSHV裂解期的DNA复制机制所知甚少，推测单链DNA结合蛋白ORF6会在病毒裂解期DNA复制及病毒与属主相互作用中起作用。我们在昆虫细胞中表达了ORF6蛋白，纯化后制备了抗体，初步分析了其单链DNA结合特性。本项目将研究ORF6对几个病毒编码的复制酶活性的影响，利用细菌人工染色体(BAC)系统构建ORF6缺失的重组病毒稳定转染细胞系，通过互补实验研究野生型及突变型ORF6在KSHV裂解期DNA复制中的作用，及其对早、中、晚期病毒基因表达的影响。该研究将有助于全面了解病毒裂解期DNA复制的机制及病毒致肿瘤的可能机制，也会为探索能否将其作为抗病毒靶点提供直接依据。

卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV ）编码至少8个开放阅读框（ORFs ），在裂解期DNA复制中扮演重要的角色。其中， KSHV的ORF6编码的单链DNA结合蛋白已被证明参与原点依赖性DNA复制。为了进一步研究ORF6在病毒生命周期中的功能，我们通过使用细菌人工染色体（ BAC）的系统构成的重组体病毒基因组野生型及ORF6基因缺失的突变型。我们筛选出了携带BAC36 （野生型）和BACΔ6（缺失型）基因组稳定的293T细胞系。BAC36细胞用TPA和丁酸钠诱导进入裂解期DNA复制并产生感染性病毒，而BACΔ6细胞则不能发生裂解期DNA复制，也不能产生感染性病毒。然而，这两种缺陷均能由ORF6的反式表达拯救。我们的研究结果提供的遗传学证据表明， ORF6是KSHV裂解性复制所必需的。携带BAC36 （野生型）和BACΔ6基因组的稳定293T细胞可以被用作工具，调查ORF6在KSHV的裂解性复制的详细功能。此外，本研究还通过构建截短体和点突变，确定了ORF6的核定位信号NLS3（KKRK）介导了ORF6的入核，KKRK属于经典的核定位序列。但是进一步研究发现ORF6蛋白N端部分序列缺失后，NLS3不能够引导蛋白入核，分别缺失N端29，59，199，399，599氨基酸序列后，截短体蛋白呈细胞质分布。当缺失699氨基酸序列后，蛋白可以入核。说明远离核定位信号的序列能够影响NLS3的入核功能。