单链DNA结合蛋白WHIRLY1转录及表观遗传调控植物衰老和细胞死亡的研究

Senescence is the last phase of leaf development finally leading to death of the tissue. This phase of development is characterized by remobilization of nutrients and in crop plants limits yield and energy transmission. It has been shown that transcription factors of the WRKY and NAC families have prominent roles in controlling the process. Our previous research has demonstrated that single stranded DNA binding proteins, WHIRLY constitute another family of transcription factors playing key role in senescence as well as in cell death processes during biotic or abiotic stresses whereby WHIRLY1 acts upstream of WRKY transcription factors. WHIRLY1 binds to the promoter of WRKY53 and activates or represses downstream WRKY gene expression and senescence events. The major goal of the project is to elucidate the molecular mechanism of the upstream regulation of WRKY transcription factors by WHIRLY1 using fluorescence in situ hybridization，ChIP sequencing， quantitative PCR and quantitative reverse transcription PCR assay. In addition, chromatin remodeling, recruitment of RNA polymerase II and epigenetic histone modification will be investigated using WHIRLY1 mutants. It aims to elucidate the molecular mechanism underlining Whirly1 actions on the downstream WRKY genes expression at the transcriptional and epigenetic levels. Furthermore, the developmental cue and environmental condition including darkness and H2O2 treatments will be included to decipher the molecular mechanism of Whirly1 upstream controls plant senescence and cell death.

本项目基于已证明单链DNA结合蛋白WHIRLY1是WRKY的上游调控因子，结合在WRKY53启动子上，激活或抑制WRKY基因的表达而调控衰老与细胞死亡的基础，利用WHIRLY1突变体通过荧光原位杂交和荧光标记技术、染色质免疫共沉淀序列分析和PCR分析以及实时定量PCR技术，寻找WHIRLY1参与调控下游基因转录的证据，即WHIRLY1是否通过改变染色质构象，或参与直接招募RNA聚合酶II，或直接和间接参与调控组蛋白的修饰等转录及其表观遗传调控事件，进而调控下游衰老相关基因WRKY53和细胞死亡相关基因WRKY33的表达，探明WHIRLY1转录及表观遗传调控下游基因表达的分子机制；并通过对不同发育时期和不同衰老和细胞死亡诱导处理材料的研究，阐明单链DNA结合蛋白调控植物细胞衰老与细胞死亡启动与进程的分子机理。这将是植物衰老调控理论的补充与深化，也为有效控制作物产量、品质和保鲜等提供理论依据。

单链DNA结合蛋白在细胞中参与了DNA复制、修复、重组、转录和端粒保护等的调控，但是在转录过程的调控至今没有直接的证据。本课题基于前期的研究基础：单链DNA结合蛋白WHIRLY1（WHY1）可以直接结合到衰老标志性调控因子WRKY53的启动子上负调控WRKY53的表达与植物衰老进程的改变，利用DAPI染色和免疫荧光组化检测了WHY1缺失和过表达突变体的染色质构象在发育过程中的变化，结果显示WHY1蛋白参与调控叶片衰老过程中全局染色质构象的变化。ChIP-qPCR结果显示WHY1突变体中WRKY53和WRKY33基因H3K4me3、H3K9ac和RNAPII富集水平的发生变化。In vitro-ChIP证实WHY1蛋白在转录起始复合物形成前抑制H3K4me3的富集，在转录延长阶段促进H3K9ac的富集和RNAPII的招募。ChIP-seq/qPCR分析WHY1蛋白在不同发育时期不同靶标基因启动子上的结合，证明WHY1蛋白对下游基因的结合和调控具有结合位点特异性并且依赖于发育时期。通过ChIP-qPCR检测WHY1缺失和过表达突变体中WHY1下游靶标基因启动子和转录区域的组蛋白修饰和RNA聚合酶II（RNAPII）在不同发育时期的富集水平的变化，证实WHY1蛋白以发育时期依赖的方式通过影响WRKY53的组蛋白修饰H3K4me3、H3K9ac和RNAPII的富集水平进而调控其转录。酵母双杂交（Y2H）筛选与WHY1的互作蛋白，发现WHY1蛋白与组蛋白脱乙酰化酶HDA互作。并通过单、双突变体验证WHY1和HDA对WKRY53基因转录的共调控作用。同时，WHY1还可以与CIPK14激酶互作，被CIPK14磷酸化，改变WHY1在细胞核与质体中的分布和功能。当WHY1被磷酸化后促进WHY1在细胞核积累，和与WRKY53和WRKY33启动子的结合活性，同时在质体中的积累减少，呈现出与why1/3双突变体相类似表型。通过暗诱导和H2O2处理证明胁迫引起WHY1蛋白在细胞内的分布和组蛋白修饰全局水平的变化，影响下游基因WRKY53和WRKY33启动子和转录区域组蛋白修饰和RNAPII的招募及其转录水平的变化。阐明ssDNA结合蛋白WHY1通过影响H3K的表观修饰和WHY1自身的磷酸化修饰调控下游靶基因转录的机理，具有重要的生物学意义，为人为调控植物衰老进程提供应用思路。