有效提高重组腺相关病毒包装效率的关键细胞蛋白的挖掘与验证

Recombinant adeno-associate virus (rAAV) is one of the most promising viral vectors. However, its packaging efficiency is only 1% of wild type AAV’s, which is the bottleneck for rAAV gene therapy. Studies show that capsid assembling and encapsidation of viral genomes are the two steps limiting rAAV packaging efficiency. Previously, we studied the relationship of genome size and packaging efficiency, and identified the cellular proteins interacted to rAAV particles. Here we propose that the cellular proteins binding to the capsid proteins and empty particles would play important roles in rAAV packaging. To identify these proteins, mRNA display will be used for screening, and pull-down and co-IP will be used for characterization. Overexpression and gene silencing will be used to study the underlying molecular mechanism for the identified cellular proteins and find out which ones are important for the packaging. Finally, the stable cell lines with regulated expressions of some key cellular proteins will be constructed to increase the packaging efficiency for our new rAAV production system. The increase of rAAV packaging efficiency would not only lower the cost of viral vectors but also decrease the possible immune response due to a large amount of defective viral particles.

重组腺相关病毒（rAAV）是目前基因治疗最成功的病毒载体，但它的包装效率不到野生型AAV的1%，是临床应用的瓶颈。分析其包装过程，衣壳蛋白聚合成病毒空壳及载体基因组进入病毒空壳是影响包装效率的两个关键步骤。本课题组曾发现一些细胞蛋白与病毒颗粒相互作用，也探讨了包装效率和基因组的关系。在此基础上，本课题提出与衣壳蛋白和病毒空壳相互作用的细胞蛋白是限制rAAV包装效率的关键。本项目将利用mRNA display技术，系统地筛选出和衣壳蛋白和病毒空壳相互作用的细胞蛋白，并通过体外pull-down以及体内免疫共沉淀技术对它们进行鉴定。随后通过基因过表达及沉默研究细胞蛋白影响包装效率的机制并找出关键蛋白。最后，在本课题组建立的新型生产系统中，通过合理调控关键细胞蛋白的表达，开发出能显著提高rAAV包装效率的稳定细胞株。优化后的生产系统将可以显著降低生产成本，减少由大量无效载体诱发的免疫反应。

重组腺相关病毒（rAAV）是目前基因治疗最成功的病毒载体，可以“一次治疗，长期有效”，欧美已有3个药物上市，但价格均在百万美元以上。究其原因，主要是由于该病毒的包装效率不高，导致生产成本高达10万美元以上，是临床应用的瓶颈。研究表明，rAAV的包装效率不到野生型AAV的1%，分析两种病毒的包装过程，我们认为衣壳蛋白聚合成病毒空壳及载体基因组进入病毒空壳是影响包装效率的两个关键步骤。本课题组曾发现一些细胞蛋白与病毒颗粒相互作用，也探讨了包装效率和基因组的关系。在此基础上，本课题提出与衣壳蛋白和病毒空壳相互作用的细胞蛋白是限制rAAV包装效率的关键。因此，本项目利用pull-down技术，将在rAAV包装过程中和病毒颗粒相互作用的细胞蛋白质分离出来，再利用高分辨率的质谱技术进行分析, 共发现257个可能的蛋白。这些蛋白涉及到病毒的多条转运途径。之后, 将这些发现的细胞蛋白通过文献及功能分析，筛选出7个进行基因敲除和基因过表达的实验，找到2个影响rAAV包装的关键蛋白。最后，利用稳定细胞株，对报告基因和治疗基因进行了规模化生产，并用生产的载体成功地进行了基因治疗，相关文章已发表。 本课题组同时对和衣壳蛋白相互作用的AAVR受体进行了深入研究。我们利用pull-down和质谱分析技术，发现了62个和AAVR相互作用的细胞蛋白，并利用共聚焦等方法对其中4个蛋白进行了验证。经过HeLa细胞体外基因敲除发现其中一个蛋白X敲除后，极大地抑制了rAAV的感染，该蛋白复合体上其它基因的敲除也有同样效果。因此，我们构建了该基因的全部和条件性敲除两种小鼠模型。rAAV-Luciferase载体注射杂合子和野生型小鼠的比较发现，杂合子的荧光信号显著低于野生型。因此该结论在in vivo的水平进一步验证了基因X和rAAV感染效率相关。据此，我们的研究发现了rAAV感染细胞的一个新的信号通路，相关文章正在整理中。