用杆状病毒在家蚕中包装基因治疗用重组腺相关病毒的技术体系研究

Adeno-associated virus (AAV) is currently considered the most promising viral vectors for gene therapy as an effective gene delivery vehicle because it possesses interesting attributes including lack of pathogenicity, sustained transgene expression, transducing dividing and non-dividing cells in various tissues or organs. A current challenge in recombinant AAV (rAAV) is finding a new system to produce large amounts of rAAV for clinical trials with relative low costs. Assembling of rAAV with baculovirus in silkworm is promising in a cheaper and scalable manner. In this study, reBmBac techniques will be used to establish a three-component production system of BmNPV. The rAAV assembled in this system will infect mammalian cells to verify its function. Purification process of rAAV will be also explored. Using BmNPV multigene expression system combined novel defective-rescue technique, a new mono-component production system of BmNPV (MonoBac) will be developed, in which rAAV assembled lipoprotein lipase (LPL) and alpha 1-antitrypsin (AAT) respectively will be produced in a large-scale level if possible. This MonoBac system for rAAV production will be optimized by infection condition, regulation elements, etc. and used to assemble different serotype rAAVs as a large-scale production platform. Studies on assembling of rAAV with baculovirus in silkworm will provide a foundation for overcoming the limitation of rAAV application in gene therapy because of high manufacturing costs.

腺相关病毒（AAV）具有低致病性，宿主细胞范围广，表达稳定等优势，成为基因治疗中最有前景的病毒载体。但对于重组AAV（rAAV）最大的挑战就是寻找高效的生产体系，满足临床研究和应用的需求，用杆状病毒在家蚕中包装rAAV是一个可行的选择。本研究利用reBmBac重组家蚕杆状病毒表达系统建立包装rAAV的家蚕三杆状病毒表达系统，在哺乳动物细胞中验证rAAV功能，并对rAAV纯化技术进行探索。在此基础上，利用家蚕杆状病毒多基因表达系统，结合缺陷型病毒失活拯救技术，建立包装rAAV的家蚕单杆状病毒表达系统，争取利用该系统包装含有脂蛋白脂肪酶和α1抗胰蛋白酶基因的rAAV载体。对用杆状病毒在家蚕中生产rAAV的技术体系进行优化，采用模块化设计，构建各型rAAV的生产平台，能快速、高效地包装含各种目的基因的rAAV，为解决目前因生产成本过高而限制AAV载体在基因治疗中应用的问题提供一种新思路。

基因治疗是生物学和医学领域的一个热点研究方向，基因呈递载体的研究则是基因治疗研究中的一个核心议题，腺相关病毒（AAV）具有致病性低，宿主细胞范围广，表达稳定等特点，成为基因治疗中最具潜力的病毒载体。但重组AAV（rAAV）最大的挑战是寻找高效的生产体系，以满足临床研究和应用的需求，用杆状病毒在家蚕中包装rAAV是一个可行的选择。本研究利用reBmBac重组家蚕杆状病毒系统，以荧光素酶和GFP为报告基因，建立了包装rAAV的家蚕三杆状病毒表达系统，在这个系统中，以常用的AAV作为代表性的血清型，将两端ITR序列中间插入CMV启动子和多克隆位点（MCS），在MCS尾端插入SV40 polyA，Cap2上游加上家蚕多角体启动子，下游加上BGH polyA；在Rep2下游加上HSV polyA。在Cap2和Rep2中添加了相应的人工内含子序列以优化其包装：在rep基因530位处以及cap基因25位处均加入intron序列。并对rAAV纯化技术进行探索，纯化后的rAAV在人肾胚细胞HEK293t细胞中进行了功能验证。在此基础上，利用家蚕杆状病毒多基因表达系统，结合缺陷型病毒失活拯救技术，将rAAV包装必需的三个表达盒：ITRs、rep和cap，同时插入到家蚕杆状病毒基因组的polyhedrin、p10、和egt位点，建立了包装rAAV的家蚕单杆状病毒表达系统，纯化后的rAAV在人肾胚细胞HEK293t细胞中进行了功能验证。并利用该系统成功地包装了含有治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症的lpl基因的rAAV病毒粒子。对用杆状病毒在家蚕中生产rAAV的技术体系进行优化，采用模块化设计，构建各型rAAV的生产平台，能快速、高效地包装含各种目的基因的rAAV，为解决目前基因治疗中AAV载体生产成本过高的问题提供一种新思路。本研究共发表论文6篇，其中SCI收录5篇；申请发明专利1项。