苹果B型MdRR1响应细胞分裂素信号应答促进花芽孕育的分子机制

Cytokinins (CTK) play key role in regulating apple flower development. However, Very few reports have investigated how the CTK signaling transducts and regulates flower induction in apple. In addition, the key genes intergrated CTK signaling transduction and flowering pathway need to discover in apple as well as in model plant. So in this study, with ‘Changfu 2’and ‘Yanfu 6’ as expremental material, we take CKs postive regulator MdRR1 which were selected our previous study as the pointcut to identify and analyse the expression pattern of main responsive genes both in upstream and downstream. Combined with the promoter analysis of MADS-Box genes releted to flower induction, operating mode will be put up. Yeast two-hybird (Y2H) system and bimolecular fluorescence complementation (BiFC) will be used to analyze the function pattern of SPL9 and MdRR1 proteins in post-transcriptional control. Yeast one-hybird (Y1H) system and EMSA will be used to analyze the function pattern of MdRR1 and MADS-Box genes (MdSOC1a/b and MdAGL24). Transgenic systems of apple and Arabidopsis will be used to identify their functions. Through the above research, the molecular mechanism of MdRR1 mediating CTK signal response to apple flower bud induction are hoped to clarify and to provide contribution in genetic improvement of apple flowering and development of flowering regulation techniques.

CTK对苹果花芽孕育具有重要调控效应，但苹果响应CTK信号后，如何传递此信号，连接CTK信号转导途径和成花途径关键结点基因有那些，有待挖掘。本项目拟以前期研究筛选出的候选关键结点基因，CTK信号转导正响应因子MdRR1为主要研究对象，以难成花品种‘长富2号’及其易成花芽变品种‘烟富6号’为材料，用外源CTK进行处理，分析MdRR1及其上下游关键基因在花芽孕育过程中的表达模式，结合MADS-Box类成花基因启动子序列的分析，筛选关键基因家族成员，提出工作模型，利用Y2H和BiFC，验证MdRR1与其上游SPL9互作关系；利用Y1H和EMSA，分析MdRR1与成花途径MADS-Box基因(SOC1a/b和AGL24)启动子顺式元件结合能力，并利用苹果转基因体系，验证其功能。通过以上研究，以期解析苹果MdRR1介导花芽孕育CTK信号应答的分子机制，为苹果成花特性的遗传改良和调控技术开发提供依据。

苹果花芽孕育调控是优质高产高效栽培的关键环节之一，作为我国的主栽品种‘长富2号’在生产上存在难形成花芽，大小年结果的问题，成为制约产业发展的瓶颈问题之一。细胞分裂素（CKs）对苹果花芽孕育具有重要的促进作用，但CKs调控苹果花芽孕育的机理研究甚少，连接CKs信号转导途径和成花途径关键结点基因有哪些，有待挖掘。本研究用CKs的人工合成剂6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）喷施花芽孕育期的‘长富2号’，结合表型统计和转录组学分析，初步形成了6-BA调控苹果成花诱导的网络模式图；进一步功能分析表明CKs信号输出关键组份MdRRB9和成花整合因子MdSOC1a/b响应外源6-BA处理促进花芽孕育，但是MdSOC1a/b不是MdRRB9的直接靶基因；MdRRB9与C2H2锌指转录因子MdZFP1可以结合，两者互作可能在CKs信号调控苹果花芽孕育过程中起重要作用。研究明确CKs可以显著促进木本果树苹果形成花芽。其诱导花芽形成涉及复杂的调控网络，6-BA诱导后，显著差异基因富集途径为激素和糖信号调控网络，构建了6-BA促进苹果花芽孕育的网络调控模式。在苹果中克隆和分析了转录组数据筛选到的启动子含B-type ARRs 结合位点成花整合因子SOC1同源基因，结果表明MdSOC1a/ MdSOC1b响应CKs且促进花芽孕育。研究排除了MdRRB9直接转录调控MdSOC1a和MdSOC1b的模式，但是MdRRB9与C2H2锌指蛋白转录因子MdZFP1物理互作，两者结合可能与CKs信号参与调控苹果花芽孕育有关，一些重要转录因子，如PIF1,3、WOX3,13、ARR2介导Cks信号参与调控苹果成花诱导过程，互作调控分析发现MdRRB9与MdZFP1转录因子互作，且两者过表达拟南芥株系均具有显著早花表型，两者可能是介导CKs信号途径诱导花芽形成的关键调控基因。该研究解析了苹果MdARR介导花芽孕育CTK信号应答的分子机制，对苹果成花特性的遗传改良，开发苹果花芽分化调控技术均具有重要理论和实践意义。