RBBP6调控NF-κB促进结肠癌细胞EMT的作用及机制研究

By Our previous study using microarray, QPCR and colon cancer tissue microarray, we found RBBP6 was related to metastasis. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a key step in cancer metastasis, and E-cad loss is a significant symbol during this process. We observed E-cad loss in RBBP6 high expression tissue, which suggests that RBBP6 is involved in EMT. Activating NF-κB by ubiquitination is an important way of regulating EMT. After silencing ubiquitination enzyme RBBP6, subunit p65 of NF-κB decreased in the nucleus. And p65 was up-regulated in RBBP6 high expression tissue. Above experiments display that ubiquitination enzyme RBBP6 can activate NF-κB to stimulate EMT and then promote metastasis. The RBBP6-NF-κB-EMT pathway may be existed in colon cancer metastasis. It needs to be confirmed. Thus in this study we will observe the effect of RBBP6 in colon cancer metastasis by gene silencing and over-expression, verify whether RBBP6 participate in EMT by markers detecting, explore the binding sites of RBBP6 on NF-κB by co-immunoprecipitation and confocal laser scanning, and study the effect of proteasome blocker MG132 on RBBP6. Our purpose is to clarify the molecular mechanisms about RBBP6 activating NF-κB to promote EMT, provide potential target for prevention and treatment of colon cancer.

课题组前期通过基因芯片、QPCR和组织芯片发现RBBP6与结肠癌转移相关。上皮间质转化(EMT)是癌转移的关键步骤，E-cad丢失是其重要标志。我们在RBBP6高表达组织中观察到E-cad丢失，提示RBBP6参与EMT发生。泛素化作用激活NF-κB是调控EMT的重要途径；我们沉默泛素化酶RBBP6后NF-κB亚单位p65入核减少，而RBBP6高表达组织中p65上调。据此分析：RBBP6通过泛素化激活NF-κB促进EMT进而诱发癌转移，结肠癌转移可能存在RBBP6-NF-κB-EMT信号途径，有待进一步证实。本课题通过①基因沉默和过表达观察RBBP6在结肠癌转移中的作用；②标志物检测验证RBBP6是否参与EMT；③免疫沉淀和激光共聚焦探讨RBBP6调控NF-κB的作用位点；④蛋白酶阻滞剂MG132进行干预研究。可望阐明RBBP6调控NF-κB促进EMT的分子机制，为结肠癌防治提供潜在靶点。

背景与目的：转移是结肠癌治疗失败的重要原因之一。本课题在前期基础上，研究RBBP6对结肠癌转移的影响，并揭示RBBP6促进转移的新机制，进而丰富结肠癌转移基因调控网络，为结肠癌治疗提供潜在靶点。.实验方法：本课题从体内、体外两个方面，分子、细胞、动物及人体四个层面展开研究。构建RBBP6敲减和过表达稳定细胞株，利用CCK-8实验、细胞划痕、Transwell实验等检测RBBP6表达变化对细胞增殖和侵袭能力的影响；构建裸鼠皮下成瘤模型和肝肺转移模型，检测RBBP6表达变化对细胞体内转移能力的影响；利用免疫组织化学染色法检测并统计分析在结肠癌组织中，RBBP6表达水平与结肠癌患者临床病理特征和预后相关性，以及E-cadherin、N-cadherin、p-p65的表达水平与RBBP6的相关性；利用免疫共沉淀和泛素化实验，阐明RBBP6调控NF-κB通路，促进结肠癌细胞EMT的分子机制。.实验结果：细胞划痕、Transwell等实验表明：RBBP6过表达后，结肠癌细胞的侵袭迁移能力增强，相反，RBBP6敲减后，细胞的侵袭迁移能力减弱；动物实验表明：RBBP6过表达促进癌细胞在体内转移，而敲减后，细胞转移能力下降；免疫组化结果显示：与癌旁组织相比，RBBP6在结肠癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织，差异有统计学意义（P ＜ 0.01）。RBBP6的表达水平与肿瘤分期，分化程度，远处转移相关。COX回归模型显示，RBBP6是独立预后因素（P = 0.012）；在结肠癌组织中，上皮标志物E-cadherin的表达与RBBP6的表达呈负相关，而NF-κB信号通路标志物p-p65、间质标志物N-cadherin的表达与RBBP6的表达呈正相关；免疫共沉淀等实验表明：RBBP6能结合IκBα，并促进其泛素化降解，从而激活NF-κB通路，促进结肠癌细胞EMT。.结论和意义：RBBP6可增强结肠癌细胞的侵袭和迁移能力；RBBP6在结肠癌组织中的表达水平升高，并且与EMT过程有关；RBBP6激活NF-κB信号通路，促进细胞EMT, 进而促进结肠癌的侵袭和转移。我们的研究结果表明，RBBP6在结直肠癌发生发展中起着举足轻重的作用，它可作为结肠癌预后的标志物，并有望成为结直肠癌侵袭和转移治疗的潜在靶点。研究成果发表在Cancer science等杂志。