长链非编码RNA遗传变异与类风湿关节炎易感性的关联研究

Previous studies mainly focused on the role of protein-coding genes in rheumatoid arthritis (RA) onset, but these findings could only explain a very small proportion of genetic variation. Recently, a large number of studies and our preliminary results suggest that long non-coding RNA (lncRNA) are implicated in RA pathogenesis, however, systemic studies on the association of genetic variations in lncRNA with susceptibility to RA are lacking. In this project, based on the established RA cohort, we will construct the lncRNA expression profile of RA patients by using RNA-Seq, determine the candidate lncRNAs and their target genes according to both the RNA-Seq results and bioinformatics; detect the single nucleotide polymorphisms (SNPs) of candidate lncRNA and their target genes, explore their correlation with genetic susceptibility to RA; for the lncRNA associated with RA susceptibility, we will further explore the influence of their overexpression and knockdown on the rheumatoid arthritis-fibroblast-like synoviocytes (RA-FLS), and test the effect of these lncRNA on RA related inflammatory factors. This project will contribute to screen the high risk population of RA, and provide new clues for further elucidating the role of lncRNA in the pathogenesis of RA.

以往研究较多关注编码基因在类风湿关节炎（RA）发病中的作用，但这些结果仅能解释小部分遗传变异。近期大量研究以及本课题组初步结果表明长链非编码RNA（lncRNA）可能参与了RA的发病，然而目前仍然缺乏lncRNA遗传变异与RA易感性关联的系统性研究。本课题拟基于已建立的RA专病队列，利用转录组测序（RNA-Seq）构建RA患者lncRNA表达谱，结合生物信息学技术确定与RA相关的候选lncRNA及其靶基因；在大样本RA病例和健康对照中进行候选lncRNA基因分型检测和关联分析。针对发现的与RA易感性存在关联的lncRNA，进行过表达和敲减，探讨其对RA患者的成纤维样滑膜细胞（RA-FLS）功能和表型的影响，并通过qPCR检测过表达lncRNA后RA相关炎性因子的表达。本项目的完成将为RA高危人群的筛查提供科学依据，并为进一步揭示lncRNA在RA发生发展中的作用机制提供新的线索。

本课题采用多阶段病例对照设计，利用全转录组测序技术，检测比较RA患者与正常对照外周血单个核细胞（PBMC）中lncRNAs表达谱，并进行独立验证，结合人口统计学资料和临床资料，建立RA患者PBMC中lncRNAs表达谱；根据测序结果确定候选lncRNAs，探讨候选lncRNAs对RA的诊断价值；对候选lncRNAs及其靶基因进行多态性检测，探讨其与RA遗传易感性的关联。在全基因组测序阶段，我们共筛选出2822个差异表达lncRNAs，其中2179个上调，643个下调。根据事先确定的候选差异lncRNAs的标准，从中筛选出12个差异表达lncRNAs进行小样本初步验证。结果发现，与正常对照相比，在新发RA患者PBMC中，lnc-BHLHE40-3，lnc-DUSP1-10，lnc-FTH1-7和lnc-ADM-1表达水平均显著上调（均有P < 0.05）；lnc-CHST15-2表达水平显著下调（P < 0.05）；而lnc-IL17REL-5，lnc-TNFAIP3-13，lnc-CD83-8，lnc-DDIT4-2，lnc-SLC2A3-1，lnc-CD82-3和lnc-IER3-6表达水平均无显著差异（均有P > 0.05）。lncRNAs（ANRIL、lnc-DC、MALAT1、ZFAS1、GAS5、linc0597和H19）在RA患者PBMC中的表达水平均低于健康对照，差异有统计学意义（均有P < 0.05）。分析lncRNAs表达水平与主要实验室指标之间的关系发现，RA患者PBMC中ZFAS1和GAS5的表达水平均与C反应蛋白（CRP）水平相关（rs= -0.278，P=0.002；rs=-0.273，P=0.017）。对lncRNAs（ANRIL、lnc-DC、MALAT1、ZFAS1、GAS5、linc0597和H19）的23个单核苷酸多态性（SNPs）位点基因分型结果进行分析发现，其基因型和等位基因频率在两组间差异无统计学意义（均有P > 0.05）。本项目的完成将有助于确定RA辅助诊断的生物学标记，筛选RA高危人群，为进一步揭示RA的发病机制提供新的线索。