低温诱导白灵菇原基形成的转录组学和DNA甲基化修饰整合分析

Pleurotus eryngii var. tuoliensis is a famous and precious mushroom of rich nutrition and high economic value. However, little is known about the genetic and epigenetics regulation mechanism on primordial formation of commercially cultivated strains of Pleurotus eryngii var. tuoliensis by low temperature induction. In this study, to overcome this limitation, the different growth stages of commercially cultivated strains of Pleurotus eryngii var. tuoliensis are used throughout this study. Based on the results of transcriptome profiling using RNA-seq, comprehensively study the changes of global transcription profiling in different growth stages subjected to cold stress treatment, involved in gene regulation and signaling pathways related to primordial formation by low temperature induction, and then the key note gene are screened, isolated and cloned, their functions and regulation mechanism in primordial formation by low temperature induction are identified. In addition, investigate the DNA methylation changes of whole genome and individual gens during the low temperature treatment by MSAP and bisulfate sequencing, and analysis the role played by DNA methylation modifications in this process. Combined with physiological response mechanism, integrative analyze of transcriptome and DNA methylation on primordial formation of Pleurotus eryngii var. tuoliensis by low temperature induction. These results will provide useful information for shorten the breeding period and reduce work of selecting strains with short production period, diminution of the energy consumption caused by industrial cultivation, and further research on the molecular mechanisms of chilling tolerance in edible mushrooms.

白灵菇是我国唯一具有知识产权的珍稀美味食用菌。目前对工厂化栽培需要低温刺激诱导其原基形成的遗传及表观遗传学研究还相当薄弱。因此，本项目以白灵菇不同生产时期（菌丝后熟期、低温刺激前期、中期、后期和原基期）为研究对象，（1）利用前期转录组测序结果，系统研究不同材料的转录谱变化，解析低温诱导原基形成的代谢调控途径和调控机理，发掘和克隆关键节点功能基因，结合超表达和RNAi方法验证关键基因的功能和作用机理；（2）利用MSAP技术和亚硫酸盐测序技术，对不同材料DNA甲基化整体水平的变化，及功能基因的DNA甲基化修饰状态的变化进行综合分析，明确DNA甲基化在低温诱导原基形成中的作用和对功能基因表达的影响。结合前期生理机制研究结果，通过整合分析，阐明低温诱导白灵菇原基形成的遗传学和DNA甲基化调控机制及相互关系，获得低温刺激的最佳时间，为有效调控白灵菇生长发育过程，减少工厂化栽培的能源消耗奠定理论基础。

白灵菇是我国近年发展迅速的珍稀美味食用菌之一。虽然近年来产量平稳上升，但白灵菇生产仍受到诸多因素的影响。低温刺激是其原基形成的重要诱发条件，没有低温刺激原基很难形成，但目前对低温刺激如何促使并加快原基形成的分子机制尚不明确。因此，本项目针对白灵菇生产中的实际问题，(1)利用RNA-seq技术对白灵菇不同生产时期（菌丝后熟完成期、低温刺激前期、中期、后期和原基期）的材料分别进行转录组de novo测序和分析，建立了白灵菇转录组数据库，构建了低温刺激不同时期的基因差异表达谱，从转录组水平研究了白灵菇不同生长发育时期基因表达的差异和变化规律，筛选出参与低温刺激诱导原基形成相关的代谢途径和候选功能基因；(2)优化了低温诱导白灵菇原基形成的培养条件，结合转录组结果进行了低温诱导后相关酶活和调控基因表达分析，结果表明低温处理后白灵菇应激反应迅速，诱导初期过氧化酶等活性明显降低，随着低温处理时间的延长，过氧化酶和漆酶相关基因表达随之上升，推测是后续子实体发育过程需要大量的碳水化合物；(3)克隆得到4个候选基因，利用CRISPR/Cas9技术进行了功能验证。与非转化菌株相比，敲除菌株不仅在常温下菌丝形态发生了明显改变，且在低温下生长速度明显变慢，特别是在低温刺激下原基生成及分化速度明显变慢，以上结果表明这些基因在白灵菇菌丝生长及低温调控原基形成过程中发挥重要的调控作用；(4)选取不同生长发育时期材料，利用MASP技术和重亚硫酸氢盐高通量全基因组测序技术明确了白灵菇全基因组甲基化水平和不同染色体上分布的甲基化修饰，发现三种甲基化修饰类型的组成规律与动物相似，解析了甲基化修饰在低温刺激诱导白灵菇原基形成各个阶段中的变化，对甲基化修饰位点进行了基因功能富集，结合转录组结果解析了低温诱导白灵菇原基形成的遗传学调控与DNA甲基化修饰机制的相互关系。因此，本项目的完成为有效调控白灵菇生长发育过程，减少白灵菇工厂化栽培的能源消耗等方面研究奠定了坚实的理论基础。