乙型脑炎病毒解旋酶载入基因组及参与复制复合体组装的机制

Helicase is one of important proteins which participating in the metabolism of nucleic acid. The viral helicase is associated with genomic replication and has become an potential target of anti-viral drugs in recent years. Helicase of Japanese encephalitis virus (JEV), encoded by NS3 gene, can not only binding viral genomic RNA but also interact with other viral replicases, and thus have important roles in assembly of replication complex. However, the roles of NS3 helicase in initiation of flavivirus replication were known very limited, many crucial details were unclear. In this project, our studies will focus on the interaction between NS3 helicase and viral genomic RNA, viral proteins, and cellular proteins. The characteristic of helicase recognized RNA sequence or secondary structure in JEV genome will be resolved by determining binding capability of different fragments of 3'NCR with NS3 helicase; This project will also screen and identify the viral proteins that interact with NS3 helicase, and then elucidate the interaction pattern and crucial amino acids; By screening and identifying the cellular proteins that interact with NS3 helicase, findind the influence of interaction on helicase activity and virus replication, this project will reveal the components that can regulate virus replication in cells. Altogether our studies will explain how the helicase participate in JEV replication complex assemble and raise new strategies for antiviral therapy.

解旋酶是参与核酸代谢过程的一类重要功能蛋白，近年来发现病毒编码的解旋酶在病毒基因组复制中具有重要的作用，已成为有效的抗病毒药物靶标。黄病毒NS3基因编码解旋酶，它既可与病毒基因组RNA相互作用，又与病毒复制过程的主要功能蛋白互作，在组装病毒复制复合体中发挥重要作用。然而目前针对解旋酶在起始黄病毒复制中的机制研究非常有限，许多关键的细节问题不明。本项目拟以乙型脑炎病毒解旋酶为对象，开展解旋酶与RNA相互作用机制的研究，阐明解旋酶识别基因组RNA的序列和结构特征，揭示解旋酶在基因组的载入机制；筛选并鉴定与NS3解旋酶互作的病毒蛋白，阐明互作蛋白的排列方式和互作的关键位点；筛选并鉴定细胞中与NS3解旋酶互作的蛋白质，分析互作对解旋酶活性及病毒复制的影响，揭示细胞蛋白通过NS3解旋酶对病毒复制进行调控的机制。本项目研究将揭示NS3解旋酶参与JEV基因组复制起始的机制，为抗病毒治疗提供新的策略。

解旋酶是多种病毒均编码的一种重要的功能蛋白，它主要是将病毒复制过程中形成的双链核酸进行解旋，以便进行病毒包装或者病毒蛋白的翻译。该蛋白功能的缺失或者抑制将造成病毒复制的降低，已成为一个重要的抗病毒药物靶标。然而在病毒解旋酶的研究上，如何与病毒其它蛋白和基因组互作并组装复制复合体机制仍不明确。本项目中围绕乙型脑炎病毒NS3解旋酶及其它重要动物病毒解旋酶开展了研究。我们通过蛋白质互作技术，鉴定了NS3解旋酶可通过与NS4B发生互作，锚定在内质网膜的复制复合体上，并进一步鉴定了NS4B与NS3互作的区域是145-175位的氨基酸；为阐明NS3解旋酶在载入基因组3’UTR时参与调控的细胞蛋白，开展了病毒3’UTR与细胞蛋白的互作研究，筛选到细胞的NONO蛋白可特异性作用于SL-IV区；基于NS3解旋酶的结构和功能，分别建立了基于解旋酶结构的抑制剂虚拟筛选方法和基于解旋酶功能的高通量抑制剂筛选方法，筛选获得了2种具有解旋酶抑制活性的化合物，该两种化合物可很好的抑制病毒复制，研究结果说明了抑制解旋酶的活性可作为抗病毒药物筛选的策略之一；猪蓝耳病毒和猪圆环病毒均编码解旋酶蛋白，而这两种解旋酶的作用机制与NS3解旋酶相比又分别存在很大不同。项目中同时开展了这两种解旋酶与基因组的互作研究。发现猪蓝耳病毒Nsp10解旋酶存在一个可预测的核酸结合结构域，但具体的核酸结合位点未知，项目中鉴定了Nsp10与基因组核酸发生互作的关键位点是C25、H32，这两个位点的突变可造成核酸结合及解旋活性的失活。猪圆环病毒的Rep蛋白是一个解旋酶蛋白，该蛋白与基因组的结合是通过形成二聚体的方式，本项目中解析了Rep蛋白形成二聚体的关键氨基酸位点，发现二聚体形成被抑制后，病毒的复制也被抑制，因而该二聚体的互作界面成为一个新的抗病毒的靶标。本项目在不同解旋酶与基因组互作研究上具有较强的创新性，为基于解旋酶的抗病毒药物设计奠定了理论基础。