利用高通量测序和荧光显微技术研究细菌耐药性产生机理

Multidrug tolerance bacterial persister cells have probably the same genome sequence as normal cells, but they show distinct phenotype, which is resulted from temporarily differential expression in transcriptome and proteom. However, the mechanism of bacterial persister formation is still far from fully understood. Here, we plan to combine two cutting-edge techniques, high throughput genome/tanscriptome sequencing and high resolution fluorescent microscopy, to study persister formation. First, we will identify differences in genome and transcriptome between persister cells and normal cells; sencond, using venus-tagged protein library for real time imaging, critical genes related to persister formation and recovery can be confirmed; then, we will further investigate the function of these genes by genetic methods, such as plate counting. Besides, we are also interested in recording the process of antibiotics killing bacteria by high spatial/temporal resolution fluorescent microscopy, which will shed light on how antibiotics functions on bacteria.

持留菌（persister）在基因上与普通细胞相同，仅仅通过转录水平和蛋白表达水平的暂时调控，产生对多种抗生素的耐药性，但是其形成机制一直没有得到足够深入的研究。我们将综合使用处于高速发展中的高通量基因测序技术和荧光显微成像技术研究细菌耐药性产生的机制：首先通过高通量基因测序技术检测持留菌和普通细菌在基因组和转录组水平上的差异；然后从荧光蛋白venus标记的大肠杆菌文库中挑选靶蛋白基因进行高通量实时的荧光显微成像追踪，找出与持留菌形成以及和持留菌生理特性相关基因；后续用涂板计数法进行基因生理功能的验证。此外，我们还将利用具有高时间空间分辨率的荧光显微技术观察抗生素进入细菌和杀灭细菌的过程，深入研究抗生素和细菌的相互作用关系。

细菌的耐药性是一种现象，具有同样基因组的细菌群体通过异质性的基因表达产生了一个细胞亚群，称为持留菌(persister)，它们能耐受抗生素治疗。持留菌形成的机制一直是细菌学研究中的热点。之前，持留菌的形成一直归因于细胞的休眠状态和生长停滞。在这些生理情况下，尽管抗生素结合到了其作用靶点，但由于细胞的代谢缓慢，抗生素无法对细菌造成伤害。在最新的研究中，白凡实验组使用单分子活体荧光成像技术，发现持留菌中积累了较少的抗生素，其原因来自于增强的细菌外排活动。这项发现表明能够高效地将抗生素泵出细胞也是持留菌形成的一个重要机制。转录组基因测序进一步证实了多重药物外排泵相关基因在持留菌有着较高的表达水平。此外，研究人员进一步揭示了在众多能够导致持留菌形成的机制中，外排作用是极其关键的，其贡献等同或超过休眠状态和生长停滞。最后，通过组合使用细菌外排抑制剂和抗生素可有效地减少持留菌的数目，提供了一种新的治疗策略来克服细菌的药物耐受性。之前的理论认为持留菌形成一般是通过“消极的被动防御战略”，最新的研究结果显示，增强外排活动将抗生素泵出从而减少细胞内药物浓度这种“积极的主动防御战略”同样起着重要的作用。这一重要发现完善了现有的关于持留菌形成的生物学机制的认识。本项目研究论文“Enhanced Efflux Activity Facilitates Drug Tolerance in Dormant Bacterial Cells ”发表于Cell子刊Molecular Cell，得到世界著名学术期刊《自然》杂志和《自然》子刊Nature Reviews Microbiology的高度评价。