亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）在烟草尼古丁去甲基化代谢中的功能研究

尼古丁是烟草次生代谢产物生物碱的主要成分，去甲基尼古丁是强致癌物质烟草特有亚硝酸胺NNN的前体，利用遗传手段降低烟草中去甲基尼古丁含量及减少NNN的生成是烟草研究中的一个紧迫问题。本项申请是在明确亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是降低去甲基尼古丁含量的重要候选基因的基础上，研究MTHFR过量表达对尼古丁转化去甲基尼古丁的影响，分析MTHFR过量表达和敲除（RNAi干扰）对尼古丁去甲基化相关化合物和尼古丁初级代谢产物的影响，利用14C标记技术研究尼古丁直接饲喂对MTHFR活性和代谢产物的影响，力求揭示亚甲基四氢叶酸还原酶对烟草尼古丁去甲基化的作用机制，为建立一个更加完整的烟草尼古丁去甲基代谢网络奠定基础；此外还将研究MTHFR基因在栽培烟草和野生烟草中的功能分化，并将获得尼古丁含量适中和低去甲基尼古丁转化率的烟草育种材料。

尼古丁是烟草次生代谢产物生物碱的主要成分，其在尼古丁脱甲基酶（CYP82E4基因编码）催化下形成去甲基尼古丁，后者是强致癌物烟草特有亚硝胺NNN的前体，因此去甲基尼古丁生成机制是烟草研究的重要课题。亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是植物四氢叶酸（THF）介导的一碳代谢关键酶，催化5，10-亚甲基THF还原产生5-甲基THF。后者的甲基基团通过同型半胱氨酸、甲硫氨酸，最后转移形成S-腺苷甲硫氨酸（AdoMet）,是众多初级和次级代谢产物合成的甲基供体。本研究发现MTHFR对CYP82E4表达有负调控效应，操纵烟草MTHFR基因表达能够使转基因烟草碱谱发生剧烈改变。通过RNAi抑制烟草MTHFR基因表达（KD株系）能够强烈诱导CYP82E4表达，导致高尼古丁转化率。相反，过表达MTHFR基因能够抑制CYP82E4基因表达，导致低尼古丁转化率。然而KD烟草一碳代谢流并未如预期被消弱，5-甲基THF下游的甲硫氨酸和AdoMet库稳定，总叶酸含量并未发生明显变化。有研究表明CYP82E4基因表达受到衰老诱导，本研究分析了叶片的乙烯合成及衰老相关基因的表达，排除了上述可能。总之，研究揭示了MTHFR在尼古丁脱甲基过程中的调控作用，在其它来源受限的情况下，其脱甲基反应可能产生大量的一碳单位可以维持一碳库的稳定。同时，本研究产生的OX株系的尼古丁转化率与对照相比明显下降，可以作为育种材料储备。