变异型APL融合基因GTF2I-RARA下调PTPN1介导的致白血病机制以及维甲酸耐药逆转策略研究

GTF2I-RARA is a novel APL fusion gene which is cloned and identified by our research group. This fusion, which is different from the classic PML-RARA, is resistant to ATRA and ATO. It is known to us that the ATRA stimulate the transcription by release the combination of fusion protein and cosuppresive moleculars. Our former researches prove that ATRA is unable to reverse the negative regulatory effects of GTF2I-RARA and its combination with HDAC3. We further found that GTF2I-RARA target lower the expression of PTPN1 by the usage of ChIP-seq. According to the dephosphorylate effect of PTPN1 on JAK-STAT signal pathway, we speculate the possible pathogenesis: GTF2I-RARA combines with HDAC3 and lower PTPN1, then spur the activation of JAK-STAT signal pathway and promote the cell proliferation. The combination between fusion protein and HDAC3 is unable to release by ATRA and lead the drug resistance. Our item plan to research the mechanism of ATRA-resistance mediated by GTF2I-RARA, and the synergistic effect by combination of ATRA and HDAC inhibitor.

GTF2I-RARA是本课题组前期克隆鉴定的一新型APL融合基因。该融合基因不同于经典的PML-RARA，对维甲酸、砷剂均高度耐药。已知维甲酸主要通过解离融合蛋白与共抑制分子的结合从而刺激基因转录。我们前期研究发现维甲酸不能逆转GTF2I-RARA与HDAC3的结合及负性调控作用。进一步通过ChIP-seq发现PTPN1是其负性调控的靶基因。鉴于PTPN1对JAK-STAT信号通路有重要去磷酸化及活性抑制作用，我们据此推测PTPN1在GTF2I-RARA阳性APL中的促癌特性并提出假说：GTF2I-RARA与HDAC3结合并下调PTPN1的表达，使JAK-STAT 通路信号活化而促进细胞增殖，融合蛋白与HDAC3的异常结合不能被维甲酸解离从而介导耐药，本项目拟研究GTF2I-RARA与HDAC3蛋白互作在致白血病机制中累及的信号途径，并探讨HDAC抑制剂-SAHA逆转维甲酸耐药的可行性。

本课题主要结果如下：生物信息学分析提示GTF2I-RARA可参与细胞生长信号,免疫系统信号等相关信号通路，通过WB发现HL60，HL60-GR，HL60-GR-PTPN1三组中HL60-GR的磷酸化水平明显增强，JAK2,STAT3,STAT6以及磷酸化JAK2,STAT3,STAT6的表达均明显增强，提示GTF2I-RARA可促进JAK2,STAT3,STAT6的磷酸化水平，激活JAK/STAT信号通路蛋白表达水平，而过表达PTPN1后磷酸化水平下降提示PTPN1可下调细胞株整体磷酸化水平以及JAK/STAT信号通路蛋白的磷酸化水平以及表达水平。我们进一步发现PTPN1与JAK-STAT 信号通路中 JAK2、STAT3、STAT6 的均存在蛋白质的结合,而荧光共聚焦观察 PTPN1 与各通路蛋白细胞内共定位发现PTPN1与JAK2、STAT3、STAT6在293T细胞的胞浆存在共定位。提示PTPN1可能通过与JAK-STAT 信号通路蛋白的结合影响其磷酸化。双荧光素酶报告基因结果提示GTF2I-RARA融合基因可明显刺激STAT3下游基因转录活性，而使用si-PTPN1敲除PTPN1同样可明显激活 STAT3下游基因转录活性。提示GTF2I-RARA很可能通过下调PTPN1来激活STAT3下游基因转录活性。进一步检测各组 JAK-STAT 信号通路调控的下游凋亡相关靶基因，结果提示在HL60-GR组中CyclinD1，Mcl-1，Bcl-xl表达均有增强，提示GTF2I-RARA可能通过上调CyclinD1，Mcl-1，Bcl-xl增强细胞的抗凋亡以及周期阻滞作用。细胞分化实验发现SAHA联合ATRA可有效刺激HL60-GR形态学分化，以及明显提高HL60-GR的CD11b阳性率，提示联用SAHA与ATRA可诱导HL60-GR向成熟的单核细胞方向分化。细胞周期实验提示联用SAHA与ATRA具有更强的周期阻滞作用。双荧光素酶报告基因结果提示在HL60-GR组中ATRA联合SAHA可有效刺激HL60-GR组下游RARE靶基因以及STAT3转录活性增强。 免疫印记法提对于HL60-GR细胞，ATRA联合SAHA可明显抑制JAK2、STAT3 以及STAT6的磷酸化程度以及蛋白表达水平.