Netrin-1对角膜缘干细胞生物学功能的影响及其分子机制的研究

Limbal stem cell is a kind of adult stem cells,the differentiation and proliferation source of normal corneal epithelium, playing a key role in the maintenance of corneal integrity and transparency.Limbal stem cell deficiency can cause corneal epithelial proliferation capacity lost, resulting in corneal neovascularization,corneal transparency decreased.Our previous study found, Netrin-1 can promote healing of corneal epithelium,suppress and back off corneal neovascularization,reduce inflammation,inhibit corneal epithelial cells apoptosis after alkali burn. However,the effect of Netrin-1 on the limbal stem biological function is still unknown. This study will be to investigate Netrin-1 protective adult limbal stem cells under the injury stress, the effect of corneal limbal stem cells proliferation and differentiation, and attempt to explain Netrin-1 molecular mechanism. The implementation of the project will be helpful to understand Netrin-1 in the treatment of limbal stem cell deficiency and the prospect of stem cells application in vitro.

角膜缘干细胞是一种成体干细胞，是正常角膜上皮增殖和分化的源泉，对维持角膜的完整性和透明度起关键的作用。角膜缘干细胞损伤会使角膜上皮增殖能力丧失，导致角膜新生血管、角膜透明度下降。我们的前期研究发现，Netrin-1可以促进碱烧伤后的角膜上皮愈合、抑制和回退角膜新生血管、减轻炎症、抑制角膜上皮细胞凋亡。但是，Netrin-1对角膜缘干细胞生物学功能的影响目前还不明了。本研究将探讨Netrin-1在损伤应激反应中对成体角膜缘干细胞的保护作用，以及对角膜缘干细胞增殖与分化的影响，并试图阐释Netrin-1其分子机制。本项目的实施将有助于探明Netrin-1在治疗角膜缘干细胞缺乏以及干细胞体外扩增中的应用前景。

我们采用大鼠角膜碱烧伤动物模型，碱烧伤后用netrin-4治疗大鼠角膜1、4和7天后，分别用裂隙灯、PCR和免疫荧光的方法来检测一系列炎症指标的变化。我们发现裂隙灯检查结果是在用药第4和7天可以明显减少角膜验证指数；PCR结果显示用药后netrin-4第2、4和7天后可以明显减少IL-1b、IL-6、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1和MIP-1的mRNA水平的表达；免疫荧光染色结果证实用药后第7天可以显著减少CD45的表达。.随后我们对轴突导向因子netrin-4在角膜新生血管中的作用分别进行了体外和体内研究。Netrin-4在血管内皮细胞和碱烧伤前后角膜的表达水平分别用了ELISA、IHC和Western blot进行检测，检测发现正常角膜和血管内皮细胞均有netrin-4的表达，而碱烧伤后第7天检测不到。体外实验发现netrin-4可以降低HUVECs的活性，调控HUVEC的增殖和凋亡。采用流式细胞仪的方法检测netrin-4对细胞周期和凋亡的影响，发现高浓度的netrin-4可以明显减少S期的细胞数量、增加细胞的凋亡。采用体外官腔形成实验发现，netrin-4可以明显抑制HUVEC的官腔形成。刮痕实验和细胞侵袭实验发现netrin-4明显抑制HUVEC细胞的迁移和侵袭。体内实验我们同样采用碱烧伤动物模型，netrin-4可以明显减轻术后第1天到底14天的角膜炎症和角膜新生血管。如果造模后第10天等新生血管长满角膜后再给药，netrin-4可以促进角膜新生血管的回退并且抑制角膜上皮细胞的凋亡。机理方面的研究，我们发现netrin-4可以影响VEGF、PEDF、NF-KB p65、PMN和ED1的表达水平，从而对炎症和新生血管进行调控。