脂代谢相关基因Apob和Hspg2互作在神经管畸形中的机制

Neural tube defect (NTD) is a multi-gene-associated complicated disease. On account of embryonic lethality and long cycle, the mouse model with human mutation is difficult to be founded. Therefore，mechanisms of multi-gene interaction in NTD are hardly been studied. Our previous introduction of CRISPR/Cas9 systems and haploid embryonic stem cell technology platform could solve the problem. We have detected a large amount of new mutations by the second generation sequencing in NTD cohort, and the genes HSPG2 and APOB double missense mutations recur in five cases of severe NTD patients, hinting the importance of both the occurrence of NTD. The two genes are both lipid metabolism related genes. The single gene knockout mice showed NTD phenotype, but the pathogenesis of human-origin mutation is far from kown, let alone the mutation interaction studies. Our project will use haploid embryonic stem cell technology to establish the Hspg2 and Apob double gene mutation mouse model, and study the function of human-origin mutant Apob and Hspg2 and its mechanism in the occurrence of NTD. This project will enrich the list of NTD prenatal genetic screening, and provide new insight into the molecular mechanism of NTD and other birth defects.

神经管畸形(NTD)是多基因复杂疾病，但因胚胎致死、周期过长等因素，多突变小鼠模型建立困难，因此多基因互作在NTD发生中的机制研究匮乏。我们前期引进CRISPR /Cas9系统和孤雄单倍体胚胎干细胞技术平台，为突破该瓶颈提供可能。我们通过二代测序在NTD患者队列中检测大量新发突变，其中在5例严重NTD患者中检出APOB和HSPG2双基因错义突变的重复发生，高度提示二者在NTD发生中的重要性。二者均为脂代谢相关基因，已知单独敲除的小鼠模型均有NTD表型，但人源性点突变的致病性不明，亦无双突变互作研究。本项目将运用前述技术建立Ａpob和Ｈspg2双基因点突变小鼠模型，深入研究人源性的Ａpob和Ｈspg2的突变及其互作在NTD发生中的机制。项目的实施将丰富NTD产前筛查基因清单，并为研究出生缺陷多基因致病机制提供重要手段和思路。

神经管畸形（Neural tube defects）NTDs发病原因复杂，可由染色体畸变、基因突变等遗传因素或环境因素引起。研究NTDs的发病机制，寻找其关键致病基因及突变，为完善早期遗传诊断体系、出生缺陷防治及试管婴儿的筛选具有重要意义。.小鼠模型是研究基因突变致病机制必要且有效的工具。在小鼠基因组中，根据人源性突变位点做相应的同源基因编辑，通过表型可以研究突变位点的致病性和机制。但是，由于NTD小鼠表型严重，往往胚胎致死，大量突变小鼠的建立面临诸多困难：周期长、成本高。所以，采用传统方法难以实现动物水平对突变的功能筛查。而借助于CRISPR/Cas9和单倍体胚胎干细胞技术，从理论上可以突破这一瓶颈。.基于此，我开展以下两个方面的工作：.第一部分：利用基于单倍体胚胎干细胞技术的“半克隆小鼠”方法，建立15个来自人NTDs病例的点突变小鼠模型。我们前期利用二代测序，发现多达15例病例携带HSPG2基因全新突变。利用“半克隆小鼠”技术我们在7个月的时间内获得所有的15个点突变Knockin小鼠，发现多个突变小鼠特别是位于第5个结构域内突变小鼠，呈现明显的NTD表型。借助于表型分析、组织学以及免疫学实验，我们对突变位点做出致病性的评判。该研究手段和思路可以为之后的出生缺陷研究借鉴。.第二部分：我们对于HSPG2基因中，位于第5结构域的突变的致病机制展开研究。借助于“半克隆技术”获得的点突变小鼠、基因标签小鼠以及多点突变小鼠，同时结合生物化学、组织学、细胞实验以及免疫学实验。我们发现HSPG2第5个结构所分离的独立蛋白结构，endorepellin分子，在早期胚胎发育过程中，对于抑制神经干细胞过早分化至关重要。并且在这个调控作用中，endorepellin主要通过神经细胞粘附因子Neurexin等抑制分化。我们这一部分工作，对于阐述HSPG2在早期胚胎神经管发育中的功能，挖掘出了新的分子机制。