地衣芽孢杆菌漆酶的定向进化及在染料脱色中的应用

Directed evolution is an effective strategy to improve enzyme properties such as activity, specificity and stability. In this work, we will use a combination of error-prone PCR and DNA shuffling to construct mutant library for directed evolution of laccase from Bacillus licheniformis strain LS04. Pichia pastoris will be selected as the host for heterologous expression of the laccase gene. A high-throughput screening method for directed evolution of bacterial laccase is going to be established based on the extracellular secretion of recombinant protein by Pichia pastoris. The mutants with high laccase activity and efficient dye decolorization ability will be screened and used for further optimization of expression in Pichia pastoris. The recombinant laccase is going to be purified, characterized and tested for its potential application in dye decolorization. The aim of the present study is to increase the activity and yield of the laccase from Bacillus licheniformis LS04. Meanwhile, the production cost can be reduced due to simple purification process of the secreted recombinant laccase, which may be advantageous for improving the industrial application of this enzyme.

酶的定向进化技术能有效用于提高酶的活性、专一性和稳定性等性质。本研究以地衣芽孢杆菌LS04的漆酶为研究对象，通过易错PCR和DNA改组技术建立突变基因库，采用毕赤酵母作为表达宿主，利用其能将重组蛋白分泌到胞外的特性，建立适合于细菌漆酶定向进化的高通量筛选方法，从突变文库中快速高效的筛选出活性高且能有效用于染料脱色的突变漆酶。在所获得高活性突变体的基础上，通过优化毕赤酵母表达条件，实现突变漆酶基因的高效重组表达。利用蛋白层析纯化系统对重组漆酶进行分离纯化，研究其酶学特性并测试其在染料脱色上的应用潜力。通过本研究的实施，在有效提高地衣芽孢杆菌漆酶活性和产量的同时，由于采用胞外表达简化了后续的纯化工艺，有利于进一步降低重组漆酶的生产成本，为推动该漆酶在工业上的应用奠定基础。

漆酶由于其催化的底物范围十分广泛，在多种工业领域具有广泛的用途，其中细菌漆酶更是由于其较好的稳定性受到较大的关注，但细菌漆酶存在产量和活性低的局限性。本项目以前期筛选到的产漆酶地衣芽孢杆菌为材料，通过随机突变方法构建漆酶基因突变文库，结合毕赤酵母胞外表达和平板显色的方法开发出适合于细菌漆酶定向进化的高效表达和筛选系统，避免了细菌漆酶在大肠杆菌中胞内表达易形成包涵体且需细胞破碎处理等缺点。从突变文库中成功筛选得到了多个漆酶活性提高的突变子，在分析突变位点的基础上选择漆酶活性提高2.1倍的突变体M5进行了同源建模分析和进一步的研究。 在优化毕赤酵母表达重组漆酶条件的同时，结合密码子优化使突变体M5的表达活性进一步得到显著提高。与未经任何优化的野生型漆酶表达量相比，突变体M5第1 d的表达活性提高了19倍左右，其中铜离子和丙氨酸的加入可极大提高漆酶活性。. 酶学性质研究发现毕赤酵母表达的重组地衣芽孢杆菌漆酶为糖蛋白，分子量约68 kDa。突变体M5催化底物的最适pH和最适温度与野生型漆酶相似，且保留了野生型漆酶耐碱性的特点，但热稳定性和耐盐性等有所下降。测试了重组漆酶对三种结构不同的染料RB亮蓝、活性黑和靛红的脱色效果，结果表明野生型和突变体M5漆酶均可在无介体存在时有效脱色靛红，6 h后脱色率均在72%以上，对RB亮蓝和活性黑无明显的脱色能力。介体乙酰丁香酮的参与极大的促进了重组漆酶对染料的脱色，在pH 6.2和9.0时，两种重组漆酶均可有效三种染料，其中靛红在1 h内基本被完全脱色，活性黑在2 h内的脱色率高达93%以上，RB亮蓝脱色效率稍低。. 围绕提高细菌漆酶产量和活性的问题，通过本项目的实施达到了提高了地衣芽孢杆菌漆酶产量的目的，突变漆酶保留了野生型漆酶的部分优良特性，在碱性条件下能有效脱色不同的化学染料，显示出在染料废水处理上具有较好的应用前景。