赖氨酸甲基化位点占有率测定新方法的建立及其用于肿瘤耐药机制的研究

Lysine methylation is an important post-translational-modification (PTM) that plays crucial roles in diverse physiological and pathological processes. Direct measurement of the methylation stoichiometry can unambiguously reveal whether the signal-induced alteration is regulated by methyltransferase/demethylase activity or by transcriptional regulation to modify protein abundance, however, no methodology is available for the high-throughput stoichiometry analysis of lysine methylation. Thus, it is of great urgency to overcome the current deficiency in accessing the stoichiometry of lysine methylation. To this end, we propose to develop an integrated approach that utilizes hM-SILAC and dimethyl labeling to determine the absolute stoichiometry of lysine methylation on a large scale. Furthermore, the newly developed methods will be utilized to the analysis of protein methylation in drug-resistance cancer cells, which could reveal the connections between lysine methylation and drug-resistance. Based on the above results, we will further investigate the relationship among methylated proteins and drug-resistance. The outcome of this project will greatly improve the technology advancement in quantitative analysis of lysine methylation.

蛋白质的赖氨酸甲基化是一种在细胞内部起着关键调控作用的翻译后修饰类型。对不同生理状态下赖氨酸甲基化的位点占有率进行测定分析，对于解析赖氨酸甲基化对生理过程的动态调控非常重要，但到目前为止，还没有相应的技术手段对赖氨酸甲基化的位点占有率进行高通量测定分析。针对这一现状，本项目拟发展一种综合了hM-SILAC标记、二甲基化衍生和PRM分析的赖氨酸甲基化位点占有率的测定新方法，实现位点占有率层次上的精准测定分析；拟将发展的技术手段用于肿瘤细胞耐药过程中赖氨酸甲基化位点占有率的差异分析，探索赖氨酸甲基化的位点占有率与肿瘤细胞耐药性之间的关联。本项目的开展实施将有效地提升我国在赖氨酸甲基化定量分析方面的技术水平。

针对蛋白质甲基化位点占有率定量分析（尤其是赖氨酸甲基化的占有率分析）中存在的问题，本项目发展了蛋白质甲基化定量分析相关的新技术和新方法，提高蛋白质甲基化的定量分析能力，在此基础之上，本项目将相关技术手段应用于肿瘤细胞耐药过程中蛋白质甲基化位点占有率的测定，以研究甲基化修饰的位点占有率与肿瘤细胞耐药性之间的关联，为探索肿瘤细胞耐药机理提供技术支持。本课题计划发表SCI论文2-3篇，申请专利1-2件，实际申请发明专利2项，发表SCI论文2篇。主要研究成果包括：1）使用常规的SCX对带有胰蛋白酶漏切位点的甲基化肽段进行富集，富集前后，甲基化肽段的比例提高了两倍，尤其是提升了赖氨酸甲基化的鉴定能力。为进一步提高甲基化鉴定数量，我们使用亲和离子色谱（IMAC）去除这些含有组氨酸的肽段。在Cu-IMAC处理之后，含组氨酸的肽段比例降低了23%。2）对5-Fu敏感细胞系（Bel）和5-Fu耐药性细胞系（Bel/5-Fu）的甲基化蛋白质组进行了分析，在Bel细胞中鉴定到307个甲基化肽段，在Bel/5-Fu细胞中鉴定到291个甲基化肽段。在甲基化位点占有率层次，231个甲基化形式有位点占有率的信息，其中89个甲基化形式具有显著性差异变化的位点占有率，包括15个上调的甲基化形式和74个下调的甲基化形式。相关数据将为细胞耐药性机制的研究提供重要的数据支撑。