建立细胞内砷形态分析新方法用于甲基化分子机制的研究

砷元素对生命健康有重要影响，体内砷的代谢形态决定其生物学效应。HPLC-ICP-MS联用等元素形态分析技术难以实时监测细胞内砷形态的含量及构成，因此，亟待建立细胞内砷形态分析新方法。本课题根据富半胱氨酸多肽结合As(III)和MMA(III)等砷形态的化学特性，构建砷形态特异性结合多肽(CXnC)n与二砷荧光素(FLAsH)结合多肽偶联的多肽标签，与荧光蛋白和细胞定位蛋白融合，转染砷代谢细胞模型，表达的融合蛋白可特异性识别砷形态，引起荧光信号的变化，基于荧光能量转移、荧光淬灭或增强原理，建立细胞内砷形态实时监测与成像技术，用大肠杆菌表达、纯化制备的融合荧光蛋白还将建立新的砷形态阵列识别与检测方法。预期本项目的研究可能实现单细胞砷形态分析与示踪，进一步用于砷的甲基化分子作用机制的实时分析,将揭示砷的甲基化对DNA甲基化及组蛋白修饰的影响，阐明砷形态对细胞信号通路和分子的直接生物学效应。

该项目是生命分析化学与分子细胞生物学交叉研究项目。目标是建立砷、硒等元素在细胞内的代谢形态分析新方法，探索砷、硒等元素与生物分子相互作用。该项目在具体实施过程中，将细胞元素形态分析新方法拓展到与硒蛋白相互作用及其调节细胞信号转导分子机制上。项目执行以来，取得了如下研究进展和阶段性成果：.1）实现砷结合肽融合蛋白在细胞中表达，并通过荧光检测和成像进行细胞内砷代谢的示踪和分析。将高亲和力iAs(III)特异性结合多肽标签(Tag)与内质网膜硒蛋白K融合表达，用二砷荧光素探针(TC-FlAsH)发现荧光信号的变化具有时间和剂量效应。多肽标签与内质网硒蛋白S(SelS)融合，转染HEK细胞表达，发现iAs(III)砷对TC-FlAsH探针与Tag反应性均有明显竞争抑制作用。.2）建立基于Flow cytometry检测细胞内砷形态的新方法。将砷结合多肽标签修饰在羧基化荧光微球表面，利用巨噬细胞吞噬模型，当砷暴露时，TC-FlAsH荧光信号衰减，并呈时间和剂量依赖性。Flow cytometry检测具有良好的线性关系。.3）利用红细胞体外砷暴露和代谢模型，建立红细胞内砷形态实时阵列分析方法。将多肽Tag与RBC共孵育，加入不同砷形态iAs(III)、iAs(V)、DMA(III)、MMA(III)、DMA(V)、MMA(V)孵育，用TC-FlAsH探针，微孔板读取荧光值。发现TC-FlAsH荧光信号对不同砷形态的反应线性，并与HPLC-ICP-MS形态分析结果相吻合。.4）发现巨噬细胞Fcgamma受体(FcγR)刺激活化，主要通过nNOS催化分泌产生低剂量的一氧化氮(NO)，其参与巨噬细胞吞噬功能，并受钙离子水平、硒蛋白K和ERK信号通路调节。.5）发现无机砷对人血管内皮细胞(HUEVC)增殖及血管生成有明显影响。Roxarsone和iAs(V)在低剂量对血管生成具有明显促进作用，高剂量则抑制血管生成。iAs(III)对HUEVC血管生成没有明显影响。砷调节血管生成与NO信号通路和VEGF的表达有关。.6）检测发现低硒砷暴露人群红细胞内砷形态累积特征。RBC累积的总砷中，蛋白结合砷在低硒人群红细胞中显著增加，游离砷明显降低。低硒人群红细胞中游离砷的分析显示，无机砷增加，DMA减低。.上述部分研究工作仍在进展之中。