非组蛋白赖氨酸二三甲基化肽段富集和分析鉴定新方法及其应用

As a common existed protein post-translational modification form, protein methylation plays an important role in protein structure and function. The low abundance of methylation leads to the great challenge to the analysis of protein methylation related research. Recently, more researches on non-histone lysine methylation attend epigenetic regulation of transcription and signal transduction. In order to make further research on the function of protein methylation, it holds the balance to develop high throughput and high reliable non-histone lysine methylation enrichment and identification method. This study intends to use biotin modified groups can occur specific reaction with unmodified or mono methylated lysine group, which will not react with bi-methylation and tri-methylation of lysine group. Then unmodified or single methylated lysine peptides will be removed by avidin coupled agarose beads. A novel method is established for the specific enrichment of lysine bi-methylation and tri-methylation modified peptide. And those peptides are analyzed and identified by mass spectrometry. It is the first time to develop a chemical enrichment method for non-histone lysine bi-, tri-methylation peptide. This method can significantly improve the selectivity for non-histone lysine bi-, tri-methylation by mass spectrometry analysis. It has high specificity, reproducibility and it is simple and easy to be operated.

作为一种普遍存在的翻译后修饰，甲基化对蛋白质的结构和功能有着重要影响。蛋白质甲基化的低丰度决定了甲基化蛋白相关研究是对分析技术的一大挑战，近期的研究发现非组蛋白赖氨酸甲基化参与表观遗传中的转录调控及信号转导，因此发展高通量、高可信性度的赖氨酸非组蛋白甲基化的富集和鉴定方法对于进一步研究甲基化蛋白的功能具有举足轻重的作用。本项目拟利用生物素修饰基团能够与未修饰或者单甲基化修饰的赖氨酸发生特异性反应,而不会与二、三甲基化修饰的赖氨酸反应的特点，通过亲和素偶联的琼脂糖微球去除未修饰或者单甲基化修饰的赖氨酸肽段，建立对二、三甲基化修饰的赖氨酸肽段的富集并进行质谱分析鉴定的新方法。本研究工作首次实现对赖氨酸非组蛋白的二、三甲基化修饰肽段的化学富集，能显著地提高二、三甲基化修饰肽段的质谱分析的选择性，并具有特异性强、重现性好、步骤简单、操作方便等特点。

蛋白甲基化修饰是一种广泛且重要的翻译后修饰。除了可以发生在组蛋白上，许多非组蛋白，如转录因子，也可发生甲基化修饰并调控蛋白质的功能，进而参与不同的生物学过程。然而，非组蛋白甲基化修饰的极低丰度，因此急需发展有效富集和检测甲基化蛋白，并确定其修饰位点。本项目围绕这一难点问题，开发了一种基于EZ-biotin试剂的亲和富集新方法，该试剂能与蛋白上未修饰或者单甲基化修饰的赖氨酸发生特异性反应，继而采用亲和素偶联的琼脂糖微球去除这些肽段，获得二甲基和三甲基修饰的肽段。通过优化生物素反应效率，特异性，优化亲和富集条件，该方法可实现对二、三甲基化修饰的赖氨酸肽段的高效富集，在Hela全蛋白中鉴定到300条Kme2肽段和217条Kme3肽段，对应106个Kme2修饰蛋白和86个Kme3修饰蛋白。采用多酶联合的质谱分析策略，在人源核糖体中鉴定到253个甲基化修饰位点，这是目前为止的最大规模核糖体甲基化数据库。此外，建立了一种基于OmpT的新型酶切新方法用于甲基化修饰鉴定，该方法可进一步应用于非组蛋白甲基化的鉴定。.以上研究有助于我们从宏观上理解非组蛋白甲基化修饰的规律，加深甲基化对蛋白调控作用的认识，为寻找有重要生物功能的甲基化修饰蛋白提供了重要线索。在本项目资助下，我们培养了两名博士毕业生，共发表了2篇高水平科研论文（SCI影响因子均>5）。.