嗜酸乳杆菌S-层蛋白介导的肠道保护与免疫调节功能及机理

In this topic, we will analysis S-layer protein (SLP) structure of L. acidophilus, discuss the protection effect and mechanism of SLP on intestinal epithelial cells apoptosis and intestinal mucosa of mice infected with pathogenic Escherichia coli, adhesion on target cells and stimulate intracellular signal transduction pathway of immunomodulatory of L. acidophilus mediated by SLP. As well as, the regulation function of SLP on rat peritoneal macrophages will be evaluated by detection the proliferation and phagocytic activity, the levels of nitric oxide ( NO), TNF-α, interleukin 1, interleukin 6, and interleukin 12 produced by mice peritoneal macrophages after stimulated by SLP. Further, we want to explore the signal mechanisms of SLP activating macrophages by investigating the effects of SLP on the pathway of PKC→NF-κB and PKC → ERK1/2→AP-1 and the transcription of TNF-α mRNA of rat peritoneal macrophages by evaluation the affection of SLP on NF-κB activity, protein expression of phosphorylation of ERK 1/2 as well as IκBa and TNF-α mRNA, NF-κB and AP-1 DNA binding activity after the macrophages stimulated by SLP. It could provide evidence for exploiting the using of L. acidophilus and its SLP in function food, also provide the experience for research the activation mechanism of macrophages by underway the present research.

本项目拟分析嗜酸乳杆菌S-层蛋白结构，探讨其抑制肠上皮细胞凋亡、介导嗜酸乳杆菌对感染致病菌小鼠肠黏膜的保护效应与机理，及其介导嗜酸乳杆菌对靶细胞黏附，激发细胞内免疫调控信号转导途径。并以小鼠腹腔巨噬细胞为模型，通过研究其对巨噬细胞增殖、吞噬活性、释放免疫效应分子NO、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12等的影响，评价其对巨噬细胞的免疫调节活性。通过研究嗜酸乳杆菌S-层蛋白对巨噬细胞信号分子NF-kB活性、IkBα蛋白、磷酸化ERK1/2蛋白和细胞因子TNF-α mRNA表达以及NF-kB和AP-1与DNA结合活性的影响，观察其对大鼠腹腔巨噬细胞PKC→NF-kB及PKC→ERK 1/2→AP-1通路的影响，探讨其激活巨噬细胞的信号机制，揭示S-层蛋白介导嗜酸乳杆菌激活巨噬细胞的本质，为嗜酸乳杆菌及其S-层蛋白应用于开发功能食品提供理论依据，同时也可为研究巨噬细胞的激活机制提供借鉴。

嗜酸乳杆菌是乳杆菌属的重要成员，作为重要的益生菌，可调节肠道免疫系统，增强机体非特异性免疫功能，对机体的健康具有重要作用，在发酵乳制品等发酵食品中应用很广泛。本研究提取嗜酸乳杆菌S-层蛋白，探讨其抑制肠上皮细胞凋亡、调控肠上皮细胞凋亡信号转导途径，介导菌株对肠上皮细胞及其粘膜的保护效应与机制，激发细胞内免疫调节信号转导途径，为嗜酸乳杆菌及其S-层蛋白应用于开发功能食品提供理论依据。.在本研究中，我们提取嗜酸乳杆菌CICC6074的S-层蛋白，利用MALDI-TOF质谱技术等方法研究初步获得其S-层蛋白的结构特性，其分子量大约为43kDa，等电点为9.43，二级结构中α-螺旋和β-折叠的比例分别是16.9%和42.3%，以及40%左右的β-转角和无规则卷曲，DSC结果表明S-层蛋白的热稳定性较高，它的两个Tm分别为38℃和92℃左右。.通过小鼠试验发现嗜酸乳杆菌灌胃后可显著抑制促炎因子IFN-γ、TNF-α及白细胞介素IL-1β水平的升高、通过提高抗炎因子IL-10水平达到免疫调节，改善病理损伤。嗜酸乳杆菌可以有效的降低肠上皮细胞的凋亡率，减少TNF-α、IL-6的生成，增加IL-8的产生，通过析因方差分析可以推测嗜酸乳杆菌的S-层蛋白参与了抑制NEC发病的过程，并且在其中减少了TNF-α的生成。.建立大鼠溃疡性结肠炎模型，研究S-层蛋白介导的嗜酸乳杆菌对肠道的抗炎作用。研究发现，肠上皮细胞凋亡率，细胞凋亡关键酶Caspase-3的表达量，Caspase-8的表达量，UC大鼠血清中TNF-α水平，IL-6水平分，IL-8的水平均明显下降。嗜酸乳杆菌S-层蛋白可以提高巨噬细胞的吞噬活性，促进免疫信号分子NO的释放、调节细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8的表达水平。.以小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为模型，研究发现S-层蛋白能显著增加巨噬细胞中TNF-α、IL-10 mRNA的表达量。S-层蛋白刺激巨噬细胞后引起IκBα的降解，NF-кB由胞浆转入核内，能够通过PKC激活ERK→AP-1这一信号途径活化巨噬细胞。利用iTRAQ技术证实了S-层蛋白激活巨噬细胞的过程涉及MAPK及NF-кB信号途径，此外还发现了另一条可能参与巨噬细胞活化的信号通路PI3KAkt。