酶敏感发夹结构反义核酸的设计、合成及对肿瘤细胞中特定基因的调控

Nucleic acid is one of the most important biomolecules. Controllable regulation of a specific nucleic acid function is extremely important to maintain the dynamic balance of cellular and organ functions as well as disease therapy (esp. cancers). The proposal is aimed to design and synthesize a new series of enzyme-responsive antisense oligonucleotides with hairpin structure and peptide loops that could be cleaved by specific proteinases (such as MMP-2 and Cathepsin B). By varying the paired positions and complementary sequences of inhibitory sense strand oligonucleotides, the enzyme-responsive antisense oligonucleotides are optimized and their antisense activities are temporally masked until the proteinases cleaved the peptide substrates to release the antisense oligonucleotides. We will evaluate the enzyme-responsive antisense oligonucleotides in solution and cancer cells, and demonstrate the relationship among the structures, thermodynamic stability and enzyme activated gene knockdown. These studies will lay the foundation of future research of enzyme-responsive nucleic acid prodrugs in model animals.

核酸是生物体内最重要的生物大分子之一。可控的核酸功能调控对维持正常细胞和器官功能的动态平衡以及基因相关疾病（特别是肿瘤）的治疗具有重要的意义。本项目拟设计、合成一系列针对肿瘤细胞过表达的蛋白酶（如MMP-2和Cathepsin B）响应的发夹结构反义核酸。将反义链核酸序列通过对上述蛋白酶响应的多肽序列连接另一段正义链核酸序列的抑制链来构建发夹结构的反义核酸。优化抑制正义链的不同序列和配对碱基，筛选出结构稳定且暂时不具有活性的发夹结构功能反义核酸。在溶液和特定肿瘤细胞水平上，系统地评价其在特定蛋白酶存在下，反义核酸的活化和对靶基因的特异性调控，阐明酶响应反义核酸的结构、热稳定性与酶激活的基因调控之间的相关关联，为在动物水平上的特定肿瘤的酶响应性反义核酸药物前药的研究奠定基础。

核酸是生物体内最重要的生物大分子之一。可控的核酸功能调控对维持正常细胞和器官功 能的动态平衡以及基因过度激活导致相关疾病（特别是肿瘤）的治疗具有重要的意义。本项目首先构建了发夹结构的蛋白酶（如MMP-2和Cathepsin B）响应型的反义核酸，并可以在溶液中实现蛋白酶刺激响应的反义核酸释放以及对靶标RNA的高效降解。为了更高效地在细胞水平上调控反义核酸和降低其脱靶以及非特异性免疫原性，我们构建了反义核酸构象更加受限的环状结构蛋白酶响应型反义核酸。在Cathepsin B蛋白酶作用下，刺激响应型的环状反义核酸可以在溶液和细胞水平上实现对靶基因的特异性降解，而且相对于Cathepsin B低表达的细胞，在Cathepsin B高表达的肿瘤细胞中，环状反义核酸可被高效激活，并且呈现肿瘤细胞选择性的靶基因敲降。同时，环状反义核酸表现为更低的非特异性免疫刺激效应。在此基础上，我们利用上述Cathepsin B刺激响应型的环状反义核酸实现了在荷瘤小鼠中致癌基因TPCP的选择性敲降以及对肿瘤生长的抑制。利用上述发现，我们也构建了非敏感性的环状反义核酸，开展了环状反义核酸对致癌miRNA（miR21和miR222）的序列特异性结合和肿瘤细胞的miRNA调控，实现了比相应miRNA的线性反义核酸更高效的目标miRNA敲降能力和激活相应的抑癌基因（如PTEN，PDCD4等）。相关工作的研究有望解决目前线性反义核酸药物存在脱靶效应和非特异性免疫刺激的副作用。